整合病理分期与围手术期循环肿瘤细胞变化：可切除非小细胞肺癌早期复发预测新模型

本文聚焦可切除非小细胞肺癌（NSCLC），探究围手术期循环肿瘤细胞（CTC）变化与疾病复发关联。构建的复发预测模型，能识别低复发风险和高复发风险患者，有助于医生精准制定辅助治疗方案，改善患者预后。

　　

一、研究背景

可切除非小细胞肺癌（NSCLC）的主要治疗方式是根治性解剖切除，该手术不仅能切除可见肿瘤，还能明确病理分期，病理分期依据肿瘤大小、淋巴结侵犯及远处转移情况而定。按照美国国家综合癌症网络（NCCN）指南，对于较晚期患者推荐辅助治疗以降低复发风险，但即便进行了完整治疗，仍无法完全避免复发。这可能是因为相同病理分期内存在差异，TNM 分期只是将生存率相似的患者归为一组。

对于 I 期 NSCLC，肿瘤大小、细胞成分、血管淋巴管侵犯、肿瘤经气腔播散以及脏层胸膜侵犯等因素都与较高的复发风险相关。II 期及更晚期的 NSCLC，由于肿瘤较大且存在淋巴结受累，预后更差。II 期患者中，淋巴结侵犯是主要的复发风险因素；在可切除的 IIIA 期患者中，跳跃性纵隔淋巴结转移与复发相关。然而，多数研究集中于高、低风险群体，未能精准识别具体的复发患者。

肿瘤的进展遵循侵袭 - 转移级联过程，包括局部组织侵袭、侵入血管或淋巴管以及远处器官转移，这表明肿瘤可通过淋巴或血管扩散。但检测微小转移较为困难，因其小于现有成像方法的识别范围。而识别循环肿瘤细胞（CTCs）或其分解代谢产物为解决该问题提供了可能。CTCs 与 NSCLC 的预后和治疗反应相关，循环肿瘤 DNA（ctDNA）、RNA 也有类似关联 。不过，CTCs 和代谢产物在预测复发方面的作用仍不明确。此前研究发现，可切除肺癌患者术后 CTCs 水平均下降，复发患者下降更显著。在此基础上，本研究旨在探究术后 CTCs 水平变化与可切除 NSCLC 疾病复发的关系，并基于围手术期 CTCs 变化建立复发预测模型。

二、材料和方法

1. 患者和入组标准：2017 年 2 月至 2021 年 11 月，120 例疑似恶性可切除肺部病变患者入组，排除确诊炎症、良性病变及肺外恶性肿瘤伴孤立性肺转移患者，最终 99 例患者接受肿瘤切除并纳入研究。研究获得长庚纪念医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书，并明确了采血时间。该研究也在 Clinicaltrials.gov 注册。
2. 术前评估、手术和术后管理：所有患者接受胸部计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描 - CT 和脑磁共振成像进行全面肿瘤分期，评估可切除性。通过二维心脏超声心动图和 6 分钟运动肺功能测试评估心肺储备功能。心肺储备功能良好的患者接受解剖性切除和纵隔淋巴结清扫术，心肺储备功能受损的患者则行楔形切除和纵隔淋巴结清扫术。术后治疗遵循 NCCN 指南，每 3 个月进行一次胸部 CT 监测，若怀疑复发则重新分期。无病生存期（DFS）定义为从手术到复发的时间，总生存期（OS）定义为从手术到最后随访或死亡的时间；未复发患者的 DFS 和 OS 则定义为从手术到最后随访的时间。
3. CTC 采样和鉴定：在术前、手术当天、术后第 1 天和第 3 天四个时间点采集外周血样本。采用两步法富集和纯化 CTCs，通过阴性选择去除红细胞和白细胞，利用上皮细胞黏附分子（EpCAM）和 Hoechst 33342 进行阳性选择以识别 CTCs。CTCs 定义为直径大于 10μm、CD45 阴性、EpCAM 和 Hoechst 33342 均阳性的细胞，使用 CytoFLEX 流式细胞仪进行识别和计数，以 3.0 个细胞 /mL 为临界值避免假阳性。
4. 统计分析：将病理分期从第八版更新至第九版 TNM 分期分类，使用 t 检验和卡方检验评估基本特征差异。由于 DFS 分析常涉及删失数据，因此采用受限平均生存时间（RMST），它表示生存曲线下特定时间点的面积，能直观反映一定时期内的平均生存时间，便于比较组间生存结局。运用混合线性模型（包括单因素和多因素分析）探究 CTCs 计数随时间的变化。基于性别、复发状态和分期进行亚组分析，随后进行交互作用分析。采用箱线图对比分析 CTCs 变化趋势，通过生存树进行三步风险分层：第一步依据 CTCs 计数选择区分复发和未复发能力最强的变量；第二步使用对数秩检验测试所有复发切点，选择 P 值最小的切点；第三步优化生存树的终端节点数量。采用自助法进行内部验证，随机抽样数据（N 选 N，有放回），使用相同切点计算对数秩检验 P 值，重复 10000 次，统计 P < 0.05 的次数。使用可靠性评分评估复发预测模型的稳定性，通过时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线计算不同时间点事件预测的 AUC 值。Harrell's C 统计量（C-index）用于衡量生存模型的区分能力，尤其适用于 Cox 回归，能评估模型对个体事件风险的排序能力，考虑了删失数据和时间依赖性，是生存分析的重要工具。所有统计分析均使用 R 语言（版本 4.2.2）完成。

三、结果

1. 患者临床病理特征：99 例 NSCLC 患者中，男性占 60.6%，非吸烟者占 69.7%。肿瘤平均大小为 2.08 ± 1.34 cm，实性成分与肿瘤比例为 0.56 ± 0.40，标准摄取值为 4.89 ± 4.81。多数患者（76.8%）为临床 I 期，肺功能和生化数据在正常范围。91.9% 的患者接受解剖性切除，8 例肺功能受损患者行楔形切除。不同时间点的平均 CTCs 计数分别为：术前 10.06 ± 12.13，术后 3.83 ± 6.60，术后第 1 天 2.71 ± 3.92，术后第 3 天 4.11 ± 5.18。79.9% 的患者为腺癌，平均肿瘤大小为 2.14 ± 1.28 cm。16.2% 的患者存在脏层胸膜侵犯，10.1% 的患者有血管淋巴管侵犯，平均清扫淋巴结数为 20.66 ± 11.71，转移淋巴结数为 0.54 ± 2.39。病理分期方面，68 例（68.7%）患者为 0 - Ia 期，31 例（31.3%）为 Ib - IV 期。
2. 不同分期患者特征比较：0 - Ia 期和 Ib - IV 期患者在影像学和临床特征上存在差异。Ib - IV 期患者肿瘤更大、实性成分与肿瘤比例更高、标准摄取值更高，第 1 秒用力呼气容积与用力肺活量比值更低，癌胚抗原和鳞状细胞癌抗原水平更高。手术方式上，1b - 4 队列中行肺叶切除术的比例更高。病理上，Ib - IV 期患者肿瘤更大，脏层胸膜和血管淋巴管侵犯率更高，转移淋巴结更多。
3. CTC 计数变化趋势：术后前 3 天 CTCs 计数显著下降，平均下降 1.89（P < 0.001）。男性下降 2.27（P < 0.001），女性下降 1.65（P < 0.001）。复发患者 CTCs 计数下降幅度（1.06，P = 0.047）小于未复发患者（2.19，P < 0.001），1b - 4 队列下降幅度（1.32，P = 0.004）小于 0 - 1a 队列（2.16，P < 0.001）。CTCs 计数中位数在术后第 1 天达到最低，第 3 天反弹，方差分析也证实了这一趋势。
4. 复发风险预测模型：基于术后第 3 天与其他时间点 CTCs 计数差异建立复发风险预测模型。0 - 1a 队列中，两层模型将 CTCs 计数差异≥2.75 的患者识别为高复发风险（G3）；对于差异 < 2.75 的患者，根据术后第 3 天与第 1 天的差异进一步分层，差异 < -0.25 的患者（G1）为低风险，被认为不太可能复发，差异≥ -0.25 的患者（G2）为中等风险。该模型可靠性评分 0.713，P 值为 0.035。1b - 4 队列中，一层模型将 CTCs 计数差异≥6.25 的患者识别为高风险，这些患者均在 2 年内复发，模型可靠性评分 0.975，P 值为 0.004。
5. 预测模型的准确性和区分能力：通过 ROC 曲线评估预测模型的时间特异性准确性。0 - 1a 队列中，模型准确性（AUC）在术后 0.5 个月时为 15.44%，10.9 个月时达到 72.61%，10.9 个月至 5 年期间保持在 72.55% - 79.33%。1b - 4 队列中，早期准确性为 38.71%，5.28 个月时升至 89.83%，随后下降，9.6 个月时为 41.6%，12.48 个月时又升至 54.38% 并维持至 5 年。在 0 - 1a 队列中，预测模型不仅能识别 DFS 更差的高风险患者（P = 0.018），在时间特异性 ROC 曲线分析中预测能力也优于第九版 TNM 分期（P = 0.048）。1b - 4 队列中，模型能识别 DFS（P = 0.0002）和 OS（P = 0.012）更差的高风险患者，但在时间特异性 ROC 曲线比较中，其区分能力与 TNM 分期相似（P = 0.539）。

四、讨论

可切除 NSCLC 术后管理的主要目标是预防疾病复发，提高 DFS 和 OS。目前的风险分层策略依赖于与复发相关的病理特征，但准确识别复发风险患者仍面临挑战，这使得医生难以精准为真正有复发风险的患者开具辅助治疗，同时可能让无复发风险的患者承受治疗副作用。近期研究表明，CTCs、ctDNA 和 RNA 可能与预后和治疗反应相关，有助于了解微小残留病的状态。基于这些生物标志物开发预测模型，有望更好地识别不同复发风险水平的患者，制定个性化治疗策略。

本研究中，术后前 3 天 CTCs 计数下降，女性、复发患者和晚期患者下降更明显，这与之前研究结果一致。CTCs 水平的变化可能预测疾病复发，反映微小残留病的存在。肿瘤大小和纵隔淋巴结侵犯与较差的生存预后相关，本研究中 0 - 1a 和 1b - 4 队列患者的疾病表现也存在显著差异。基于这些发现，研究构建了结合病理分期和四个采血时间点 CTCs 计数变化的复发预测模型。

在 0 - 1a 队列中，特定 CTCs 计数差异的患者被认定为低复发风险，不太可能复发；1b - 4 队列中，CTCs 计数差异达到一定标准的患者为高复发风险，均在 2 年内复发。这意味着高风险患者应接受辅助治疗、维持治疗并密切监测。模型的内部验证显示出较高的可靠性，0 - 1a 队列可靠性评分 0.713，1b - 4 队列可靠性评分 0.975。随着时间推移，复发预测的准确性有所提高，0 - 1a 队列 5 年准确率在 72.55% - 79.33%，与术后 9 - 12 个月的复发高峰相符；1b - 4 队列早期准确率较低，5.28 个月时显著提高，之后因系统治疗使 CTCs 水平下降而降低。

与 TNM 分期相比，0 - 1a 队列中预测模型在识别高风险患者和时间特异性 ROC 分析中表现更优；1b - 4 队列中两者区分能力相似，可能是由于疾病表现复杂和辅助治疗的影响，需要进一步研究。

本研究的复发预测模型虽有前景，但存在局限性。样本量有限，需要外部验证；目前对于用于复发预测的生物标志物尚无统一标准，本研究选择 CTCs 是因其在预测恶性肿瘤方面特异性高且与微小残留病相关。该模型结合了宏观和微观肿瘤特征，有助于提高复发预测能力，但对微小残留病的定义还需进一步研究。此外，第九版肿瘤分期系统中 N2 淋巴结受累相关的分期迁移仅在 1b - 4 队列中观察到，未影响亚组分析。虽然预测模型的随访期可能未涵盖所有复发事件，但多数复发发生在首次复发的两个高峰内。尽管存在这些不足，该复发预测模型仍具有临床应用潜力，有望为患者提供更个性化的治疗方案，改善预后。