揭秘脓毒症免疫抑制新机制：SAMSN1 通过 KEAP1-NRF2 通路的关键作用

这篇研究发现，脓毒症患者中 SAMSN1 表达升高且与死亡率相关。SAMSN1 通过 KEAP1-NRF2 信号通路，诱导巨噬细胞表达共抑制分子，导致 T 细胞耗竭。阻断 SAMSN1 可改善脓毒症小鼠生存率，为脓毒症诊疗提供新靶点。

　　

引言

脓毒症是由宿主对感染的失调反应引起的危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房入院的常见原因，死亡率约 22.5%。过去认为脓毒症发病机制核心是过度炎症反应，但针对炎症介质的临床试验均失败。2016 年 Sepsis-3 提出，感染引起的宿主反应失调才是脓毒症发病核心，免疫抑制是其中重要部分，表现为免疫抑制因子分泌增加、免疫抑制表面分子表达增多等。然而，脓毒症免疫抑制的触发机制、对宿主免疫反应的影响及分子机制尚不清楚。

SAMSN1，又名 HACS1 或 SLy2，在肿瘤细胞中高表达，早期研究表明其在 B 细胞发育等方面有作用。但 SAMSN1 在脓毒症诱导的免疫抑制中是否发挥作用尚不明确。本研究旨在探究 SAMSN1 表达与脓毒症的关系，以及其在脓毒症早期免疫病理中的作用。

方法

1. 伦理审批：回顾性研究数据来自他人研究，使用人外周血单个核细胞（PBMCs）进行 RNA 测序（RNA-Seq）的观察性研究获四川大学华西医院生物医学研究伦理委员会批准，动物实验获四川大学动物伦理委员会批准。
2. 回顾性研究：回顾性队列来自已发表研究人群，包括四川大学华西医院 ICU 患者和同期社区招募的健康对照。收集患者基本信息、生命体征、血液检查等多方面数据，主要结局为住院死亡率，采用倾向得分匹配（PSM）平衡脓毒症患者和健康对照的基线特征。
3. 盲肠结扎穿孔（CLP）：使用野生型（WT）C57BL/6 小鼠和 SAMSN1 基因敲除（Samsn1^?/?）小鼠，均为 8 - 10 周龄、20 - 25g 雄性小鼠。手术前小鼠麻醉，进行 CLP 手术或假手术（Sham），术后给予抗生素、补液和镇痛治疗，监测小鼠体重和临床评分。
4. 定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）：从样本中提取总 RNA，进行逆转录和 PCR 反应，采用 2^?ΔΔCt法评估 mRNA 表达，以 18S 核糖体 RNA（rRNA）为内参。
5. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：收集 Sham 或 CLP 手术后小鼠血清，检测 IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）等多种指标。
6. 细胞系构建：使用 RAW264.7 细胞和人胚肾 293（HEK293）细胞，利用 CRISPR/Cas9 系统构建 Samsn1^?/? RAW264.7 细胞（RAW264.7-KO）和 SAMSN1 拯救细胞系（RAW264.7-Rescue），并使用化学调节剂 ML385（NRF2 抑制剂）和 KI696（NRF2 激活剂）调节细胞内 NRF2 信号。
7. 生存研究：将小鼠分组进行 Sham 或 CLP 手术，监测 14 天内小鼠生存情况。
8. 苏木精 - 伊红（H&E）染色和组织学评分：对脓毒症小鼠进行麻醉和心脏灌注固定，取肝脏、肺和肾脏进行 H&E 染色，按照标准进行评分。
9. 细胞增殖实验：计数细胞后接种于 96 孔板，加入脂多糖（LPS）刺激，不同时间点加入 Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测细胞增殖率。
10. 血细菌载量检测：CLP 手术后 12 小时采集脓毒症小鼠血液样本，接种于血琼脂平板，计数细菌菌落形成单位（CFUs）。
11. 细菌吞噬实验：使用绿色荧光蛋白标记的大肠杆菌（E. coli-GFP），将 RAW264.7-WT 和 RAW264.7-KO 细胞与细菌共培养，检测巨噬细胞的吞噬活性。
12. 凋亡细胞吞噬实验和原代腹腔巨噬细胞（PPMs）分离：构建绿色荧光标记的凋亡 Jurkat 细胞，与 PPMs 共培养，检测 PPMs 对凋亡细胞的吞噬能力。
13. 流式细胞术：采集 CLP 手术后 WT 和 KO 小鼠的外周血、脾脏和骨髓样本，制备单细胞悬液，用不同标记物染色，使用 BD LSRFortessa 流式细胞仪检测细胞表面标记物表达。
14. 小鼠脾 CD3⁺ T 细胞分离和共培养：获取小鼠脾脏，分离纯化 CD3⁺ T 细胞，与 RAW264.7 细胞直接或间接共培养，检测 T 细胞数量变化。
15. RNA 测序（RNA-Seq）：从 WT 和 KO RAW264.7 细胞中提取总 RNA，进行 mRNA 富集、cDNA 合成等一系列操作后测序，对数据进行主成分分析（PCA）、差异表达基因（DEGs）鉴定和功能富集分析。
16. 蛋白质免疫印迹（WB）：获取蛋白质样本，定量后进行 SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭，与一抗和二抗孵育，使用增强化学发光法检测蛋白条带。
17. 免疫沉淀 - 质谱（IP-MS）和免疫共沉淀（Co-IP）：使用抗 SAMSN1 抗体和抗 NRF2 抗体免疫沉淀 RAW264.7 细胞中的蛋白质，进行质谱分析或 WB 检测。
18. 基因表达综合数据库（GEO）数据集：研究使用了 8 个来自 GEO 数据库的数据集。
19. 统计分析：数据以均值 ± 标准差（SD）或 n（%）表示，根据数据分布情况选择合适的统计方法，P<0.05 为有统计学意义。

结果

1. SAMSN1 表达与脓毒症患者生存率负相关：通过分析 GEO 数据库中脓毒症患者和健康对照的基因表达差异，筛选出 3 个数据集进行分析，发现 SAMSN1 在脓毒症患者中表达显著增加。使用 59 例脓毒症患者和 27 例健康对照的 PBMCs 的 RNA-seq 数据进行临床验证，结果一致。且 SAMSN1 水平与凝血、炎症和代谢指标相关，高表达 SAMSN1 的患者死亡率更高。
2. 阻断 SAMSN1 提高脓毒症小鼠生存率并减轻急性器官损伤：在 CLP 小鼠模型中，CLP 组小鼠外周血、骨髓、脾脏和肝脏中 Samsn1 mRNA 和蛋白水平显著高于对照组。Samsn1^?/?小鼠在 CLP 手术后生存率提高，体重变化小，症状评分轻。制备的 5 种抗 Samsn1 单克隆抗体中，mAb-10-A2-H10 显著提高 CLP 小鼠生存率。H&E 染色和组织学评分显示，Samsn1^?/?小鼠肺和肾损伤减轻，血清中 ALT、AST、CREA 和尿素水平变化也表明其器官损伤较轻。
3. SAMSN1 阻断增强巨噬细胞增殖、吞噬和血液细菌清除能力：SAMSN1 在脓毒症患者 PBMCs 的单核细胞和巨噬细胞中高表达。以 RAW264.7 细胞为模型，发现 RAW264.7-KO 细胞在 LPS 刺激下增殖能力更强，吞噬 GFP 标记的大肠杆菌和凋亡 Jurkat 细胞的能力也更强。Samsn1^?/?小鼠血液中的细菌在 CLP 手术后被大量清除。
4. SAMSN1 影响正常和脓毒症小鼠免疫细胞群体和 T 细胞亚群功能：CLP 手术后 12 小时，Samsn1^?/?小鼠脾脏和骨髓中 CD3⁺、CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞数量和比例增加，髓系细胞数量减少，B 细胞数量和比例略有增加。Samsn1^?/?小鼠外周血和脾脏中 CD3⁺CD8⁺granzyme B⁺细胞以及外周血中 CD3⁺CD4⁺TNF-α⁺细胞百分比显著高于 WT 小鼠。
5. SAMSN1 通过巨噬细胞与 T 细胞直接接触介导 T 细胞抑制：将 RAW264.7 细胞与原代 T 细胞共培养，发现 RAW264.7-KO 细胞与 T 细胞直接共培养 12 小时后，T 细胞数量显著多于与 RAW264.7-WT 细胞共培养的情况，而 Transwell 间接共培养不影响 T 细胞数量，表明巨噬细胞可能通过直接接触减少 T 细胞数量，Samsn1 基因敲除抑制了这种作用。
6. SAMSN1 介导的 T 细胞耗竭可能通过上调巨噬细胞表面分子表达实现：RNA-Seq 分析发现 RAW264.7-KO 和 RAW264.7-WT 细胞的基因表达存在差异，筛选出与免疫反应相关的基因，其中 CD48、CD86 和 CEACAM1 可能介导巨噬细胞与 T 细胞的相互作用。流式细胞术验证 RAW264.7-KO 细胞表面这三种分子的表达显著低于 RAW264.7-WT 细胞，提示 SAMSN1 可能通过上调这三种分子的表达介导 T 细胞耗竭。
7. Samsn1^?/?小鼠 T 细胞耗竭相关受体表达降低，T 细胞激活和信号转导增加：Samsn1^?/?小鼠脾脏中 CD3⁺ T 细胞表面 2B4、CD152 和 TIM3 表达显著降低，脓毒症时脾脏 T 细胞表面激活受体 CD69 表达增加，ZAP70 和 LCK 的磷酸化水平也显著增加，表明 T 细胞活性增强。
8. SAMSN1 通过与 KEAP1 结合调节下游基因转录：IP-MS 分析发现 SAMSN1 与 KEAP1 在 LPS 刺激下相互结合。分析公共数据库发现，Keap1 基因敲除后，Cd48、Cd86 和 Ceacam1 表达显著降低。使用 NRF2 抑制剂 ML385 和激活剂 KI696 处理细胞，qPCR 结果表明 NRF2 是 SAMSN1 的关键下游调节因子，促进共抑制分子的转录。Co-IP 分析显示，Samsn1 基因敲除增加了 KEAP1 与 NRF2 的结合，抑制了 NRF2 的转录活性。

讨论

本研究表明，SAMSN1 在脓毒症相关免疫抑制中起重要作用。它主要在单核细胞和巨噬细胞中表达，通过与 KEAP1 结合，使 NRF2 从 KEAP1-NRF2 复合物中解离并进入细胞核，促进共抑制分子 CD48/CD86/CEACAM1 的转录，这些分子与 T 细胞表面相应受体结合，诱导 T 细胞耗竭。

研究采用数据驱动的研究范式，先通过生物信息学分析筛选候选基因，再用功能实验和治疗实验确定其功能和机制。这种方法确保了研究结果的客观性，为潜在的转化应用提供了可靠依据。

SAMSN1 属于 SLy adaptor 蛋白家族，与家族成员 SLy1、SLy3 结构相似但功能有差异。SLy1 在淋巴细胞中表达，其敲除导致多种免疫细胞功能变化，与 SAMSN1 在免疫中的作用相反；SLy3 在其他细胞中广泛表达，与 SAMSN1 在促进细胞增殖等方面有功能共性。

通过 IP-MS 和转录组测序分析，确定 NRF2 是 SAMSN1 的关键下游分子。NRF2 在生理和病理过程中发挥多种作用，在脓毒症中，它在抵抗氧化应激的同时，也诱导了过度的抑制信号，导致宿主反应失衡。

总之，本研究揭示了脓毒症免疫抑制的新机制，为脓毒症的诊断和治疗提供了新靶点。SAMSN1 表达与脓毒症患者预后相关，阻断 SAMSN1 可提高脓毒症小鼠生存率，有望为脓毒症的诊疗带来新的突破。