利用单 BMSC 源软骨类器官实现梯度异质性骨软骨再生：解锁自然血管微环境的潜能

关节软骨和软骨下骨损伤常导致骨软骨缺损（OCDs），其再生面临诸多挑战。研究人员开展了利用单骨髓间充质干细胞（BMSC）源软骨类器官，借助自然血管微环境实现梯度异质性骨软骨再生的研究。结果证实该方法可行有效，为 OCDs 修复提供新策略。

　　在人体的关节世界里，关节软骨和软骨下骨就像一对紧密合作的伙伴，共同维持着关节的正常运转。然而，当受到创伤或患上骨关节炎时，这对伙伴就会受到伤害，引发骨软骨缺损（OCDs）。正常的骨软骨结构由关节软骨、钙化软骨和软骨下骨三层组成，它们之间过渡自然且具有梯度异质性。但关节软骨没有血管，依靠滑膜液获取氧气和营养，这使得它的自我修复能力很差；而且这种梯度异质性也给修复工作带来了很大困难。目前，虽然有多种临床治疗方法，像关节镜清创、微骨折、干细胞移植和自体 / 异体移植等，但都无法实现具有梯度异质性的软骨和软骨下骨的一体化再生。传统的组织工程方法在动物模型上虽有一定进展，可还是难以复制出天然骨软骨组织的平滑过渡结构，和临床需求之间存在较大差距。

为了解决这些难题，来自海南总医院（海南医学院附属医院）、东南大学附属中大医院、同济大学附属上海肺科医院、成都医学院第二附属医院等机构的研究人员开展了一项研究。他们致力于利用单 BMSC 源软骨类器官，借助骨软骨组织内自然的血管化梯度，实现梯度异质性骨软骨再生。研究结果显示，该方法成功引导了软骨类器官在特定部位分化为软骨细胞和成骨细胞，同时实现了软骨和骨的再生，证实了这种策略的可行性和有效性。这一研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上，为骨软骨缺损的修复提供了新的方向和希望，在再生医学和组织工程领域具有重要意义。

研究人员在实验过程中用到了多个关键技术方法。首先是细胞相关技术，从兔子体内分离出 BMSC，并对其进行鉴定和分化潜能评估；接着通过 3D 培养技术，在定制的琼脂糖模具中培养 BMSC 形成软骨类器官。之后运用分子生物学技术，如定量实时聚合酶链反应（qPCR）、蛋白质免疫印迹（western blotting）、RNA 测序等，来研究软骨类器官在不同微环境下的分化情况。在体内实验方面，构建了裸鼠和兔子的动物模型，通过皮下植入和骨软骨缺损植入等实验，借助 Micro-CT、组织学染色等技术评估软骨和骨的再生效果 。

研究结果

1. 兔 BMSC 的分离、鉴定和分化评估：观察 P₀ BMSC 形态，发现其随培养时间逐渐贴壁并铺满培养瓶。对 P₂-P₆ BMSC 进行鬼笔环肽染色，发现 P₂和 P₃的细胞骨架形态均匀，之后逐渐收缩。通过流式细胞术和免疫荧光染色分析表面标记，确定至少传代 3 次可去除造血细胞，且 P₃之前的 BMSC 增殖能力、细胞形态和多向分化潜能最佳，因此选择 P₃ BMSC 用于后续实验。
2. 利用传代 BMSC 开发软骨类器官：使用光刻技术制作模具，得到的琼脂糖复制品有近 2000 个微腔，为 BMSC 球体生长提供空间。将 P₃ BMSC 接种培养，3D 培养的 BMSC 球体逐渐形成软骨类器官，而 2D 培养的 BMSC 无法形成。3D 培养的细胞活力、增殖能力和软骨分化能力都更强，通过多种染色和检测方法都证实了 28 天成功构建出软骨类器官。
3. 体外评估软骨类器官在无血管和血管微环境中的分化：用血管内皮生长因子（VEGF）与软骨类器官共培养，通过 qPCR、western blotting 和免疫荧光染色分析发现，无 VEGF 的微环境促进软骨分化，有 VEGF 的微环境促进向成骨方向的肥大分化，表明软骨类器官在 VEGF 处理下具有双向分化潜能，且体内血管微环境梯度可能驱动软骨和骨组织再生。
4. 血管和无血管微环境中类器官 / GelMA 复合物的体内软骨和骨再生评估：构建含或不含阿昔替尼（Axitinib）的双层类器官 / GelMA 复合物，植入裸鼠皮下。通过组织学染色、Micro-CT 成像和免疫荧光染色发现，阿昔替尼处理的层促进软骨再生，未处理的层促进骨再生，证明血管微环境是引导软骨类器官软骨内骨化的关键因素。
5. 兔 OCD 模型中类器官 / GelMA 圆柱体的梯度异质性骨软骨再生：制备完整的类器官 / GelMA 圆柱体，植入兔 OCD 模型。通过大体观察、Micro-CT 成像、组织学染色和免疫组化分析发现，类器官 / GelMA 组骨软骨再生效果最佳，且该圆柱体生物安全性良好，证实其能在自然梯度血管微环境调节下实现梯度异质性骨软骨再生。

研究结论与讨论

本研究成功利用单 BMSC 源软骨类器官实现了梯度异质性骨软骨再生。研究过程中选择 P₃ BMSC、采用有利的 3D 培养系统、证实类器官 / GelMA 复合物在不同微环境下的再生能力、植入类器官 / GelMA 圆柱体形成再生平台，以及利用自然梯度血管微环境，这些因素共同作用，实现了骨软骨组织的成功再生。该研究成果为解决异质性骨软骨修复难题提供了可靠且与临床相关的方法，为再生医学和组织工程的未来发展奠定了坚实基础，有望在未来临床治疗中发挥重要作用，帮助更多骨软骨缺损患者恢复健康 。