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在养猪业中，猪呼吸道疾病综合征（PRDC）因 SIV、PRRSV 和 PCV2 等病毒肆虐，严重影响经济效益。研究人员开发三重 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR（qPCR）检测法，该法特异性强、灵敏度高，与国家标准法检测结果一致，为兽医学诊断和公共卫生监测助力。
在现代养猪产业中，猪群的健康问题一直是养殖户们头疼的难题。其中，猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）就像一个隐藏在暗处的 “杀手”，频繁出没在猪舍中，给养猪业带来了巨大的经济损失。PRDC 主要由猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）等病毒引起 。这些病毒不仅会让猪生病，影响它们的生长速度和肉质，还可能通过 SIV 的人畜共患特性，威胁人类健康。而且，现有的检测方法要么效率低，要么无法同时检测多种病毒，在面对不断出现的新病毒亚型时更是力不从心。因此，开发一种快速、准确又高效的检测方法迫在眉睫。
为了解决这一难题，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所和西南大学动物医学院的研究人员展开了深入研究。他们成功开发并验证了一种三重 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR（qPCR）检测法，用于同时检测 SIV、PRRSV 和 PCV2。这一研究成果发表在《BMC Veterinary Research》上，为猪呼吸道疾病的防控带来了新的希望。
研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先是引物和探针设计技术，他们基于 SIV 的 M 基因、PRRSV 的 M 和 N 基因以及 PCV2 的 Cap 基因的保守区域，设计出特异性引物和探针。其次是核酸提取与反转录技术，从临床样本中提取病毒 DNA 或 RNA，并反转录成互补 DNA（cDNA）。最后，通过构建标准质粒，为后续实验提供标准模板 。研究使用的样本来自中国西南部地区表现出呼吸道疾病症状的 110 份临床样本，包括患病组织和鼻拭子。
下面来看具体的研究结果：
- 优化反应体系和条件：研究人员对引物和探针浓度、退火温度等参数进行优化。经过一系列实验，确定了最佳退火温度为 60°C，优化后的反应体系能有效降低非特异性扩增，提高检测效率12。
- 特异性验证：以 PRRSV、PCV2、SIV 等病毒为阳性对照，PRV、CSFV 等病毒及细菌为阴性对照，结果显示设计的引物和探针能特异性识别并扩增目标病毒基因片段，对无关病原体无扩增或荧光信号，证明了该检测法的高特异性3。
- 标准曲线建立：选取 6 种不同浓度的质粒建立标准曲线，SIV、PRRSV 和 PCV2 的决定系数（R2）均接近 1，扩增效率在 90 - 110% 之间，表明模板质粒浓度与 Ct 值呈良好线性关系，可用于核酸定量分析4。
- 灵敏度评估：通过对标准质粒进行 10 倍系列稀释检测，确定该检测法对 SIV 的灵敏度为 100 copies/μL，对 PRRSV 和 PCV2 的灵敏度为 10 copies/μL。当 Ct 值≤36 时，样本判定为阳性5。
- 重复性评估：用不同浓度标准质粒进行批内和批间实验，批内变异系数（CV）≤1%，批间 CV≤5%，说明该检测方法稳定性和可靠性高6。
- 共感染检测：使用标准质粒模拟临床样本中的混合感染，结果表明该三重 qPCR 能够同时检测出两种或三种病原体7。
- 临床样本检测：对 110 份临床样本检测发现，PRRSV 阳性率为 10.9%，PCV2 为 7.2%，SIV 为 2.7%，部分样本存在共感染情况。与国家标准检测方法对比，符合率达 100%，证实了该检测法在临床诊断中的可靠性8。
- 系统发育分析：对部分临床阳性样本进行基因分析，构建 PRRSV 和 PCV2 的系统发育树。结果显示 PRRSV 阳性样本分为 1 型和 8 型两个主要谱系，PCV2 存在 PCV2b、PCV2c、PCV2d 和 PCV2e 等亚型，其中 PCV2d 亚型占主导910。
在研究结论和讨论部分，该三重 qPCR 检测法可快速、灵敏且准确地检测猪呼吸道疾病相关的三种主要病原体，不受其他病原体干扰，为猪呼吸道疾病的早期诊断提供了可靠工具。通过临床样本检测，了解到不同病毒在猪群中的感染情况，为疾病防控提供了数据支持。同时，系统发育分析揭示了病毒的遗传变异情况，有助于及时发现新的流行毒株，制定针对性防控策略。这一研究成果对于保障猪群健康、提高养猪业经济效益以及维护公共卫生安全都具有重要意义，为猪呼吸道疾病的防控开辟了新的道路，让养猪业在面对病毒威胁时有了更有力的武器。
