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本文聚焦小麦及其近缘种基因克隆，阐述了基因组学发展如何助力这一研究。介绍了基于图谱克隆、诱变等多种克隆策略，分析其优缺点，还提及基因功能验证方法。这些进展为小麦遗传改良提供关键支撑，推动小麦育种研究。
引言
小麦是重要的粮食作物，为全球大量人口提供热量和蛋白质。其产量稳定及提升对保障粮食安全意义重大。“绿色革命” 时期，矮化基因 Rht-B1b 和 Rht-D1b 的应用显著提高了小麦产量。如今，随着人口增长，挖掘新基因 / 等位基因对有效育种愈发关键。基因克隆包括候选基因识别和功能验证，明确基因序列对分子育种和功能分析至关重要。
小麦基因克隆的历史回顾
早期小麦基因克隆主要采用基于同源性和基于图谱的克隆方法。基于同源性的克隆依据与其他物种已克隆和表征基因的同源性来识别基因，受限于物种间保守基因。基于图谱（或定位）的克隆则几乎可克隆任何感兴趣的基因，无需预先知晓基因序列，曾是基因识别的首选方法。
基于图谱的克隆依赖遗传和 QTL 定位以及多种分子方法。首先要构建映射群体，通常用表型差异的亲本杂交获得，如 F2、DH 或 RIL 群体，100 - 200 个个体可用于粗略遗传定位。对群体进行全基因组分子标记基因分型和目标性状表型分析，构建包含数百到数千个标记的遗传图谱，再进行 QTL 分析确定性状变异相关位点。若涉及多个位点，需 “孟德尔化” 处理，只让选定克隆的位点影响表型变异。定位到的位点常需进一步精细定位，通过对大量杂合植株后代进行侧翼标记基因分型，筛选重组个体，用新标记饱和目标区域，缩小目标区间。最后获取目标区域序列并注释，识别候选基因。
最初用于遗传图谱构建的标记是基于限制性片段长度多态性（RFLP），但 RFLP 标记不足以构建高密度遗传图谱，后来国际合作开发了 SSR（简单序列重复）、EST（表达序列标签）等其他标记。同时，可通过与近缘物种的共线性研究获取额外标记。2014 年国际小麦基因组测序联盟（IWGSC）发布面包小麦基因组草图，推动了标记开发。
获取精细定位区域的序列信息，需构建物理图谱，常用染色体步移法筛选细菌人工染色体（BAC）文库。BAC 文库构建曾局限于小基因组，后来才在小麦等大而复杂基因组中取得进展。首个 BAC 文库来自二倍体小麦物种，之后四倍体、六倍体小麦的 BAC 文库也相继构建，还出现了品种特异性 BAC 文库。2000 年，小麦染色体流分选技术优化，有助于构建物理图谱。
NGS 时代的图谱克隆
近年来，测序技术的进步极大地降低了小麦图谱克隆的难度。捕获阵列或基因分型测序（GBS）等技术加速了映射群体的基因分型，可一次分析获得数百到数千个基于单核苷酸多态性（SNP）的分子标记，助力构建更高密度遗传图谱，提高 QTL 定位准确性。参考基因组序列的可用性方便了精细定位新标记的设计，也可通过对亲本染色体测序实现。已有多种小麦及其近缘种的高质量参考基因组序列发布，有助于候选基因识别。若目标基因不在参考基因组中，则需生成携带该基因品系的序列信息。如今，长读长测序平台如太平洋生物科学（PacBio）和牛津纳米孔技术（ONT）可替代繁琐的 BAC 文库构建和染色体步移，能在数月内生成跨越目标区域的兆碱基大小支架，高效获取映射区域序列。
诱变 —— 快速基因克隆的途径
诱变是直接确定候选基因的有效策略。基于诱变的克隆方法通过比较多个突变体与野生型基因组序列来实现。一般先在突变群体中鉴定功能缺失突变体，对多个独立突变体和野生型进行测序，将突变体序列读数映射到野生型从头组装序列上，分析单核苷酸变异，确定所有检测突变体中都存在突变的重叠群，进而识别候选基因。
最常用的诱变剂是甲基磺酸乙酯（EMS），能产生随机且相对均匀分布的 G/C 到 A/T 转换。EMS 处理后，二倍体平均每 Mb 约有 5 - 11 个 SNP，四倍体和六倍体约有 20 - 42 个 SNP，增加了在目标基因中获得功能突变的概率。但在小麦等大而复杂基因组中，全基因组重测序效率不高，需降低基因组复杂性。
捕获阵列可用于降低基因组复杂性，在克隆抗病基因方面应用广泛。许多植物抗病基因编码 NLR 家族的细胞内免疫受体，基于保守 NLR 序列开发的捕获阵列能特异性富集 NLR 编码序列。如 Jupe 等人开发的捕获阵列，Steuernagel 等人利用的 RenSeq（抗性基因富集测序）与 EMS 诱变结合的 MutRenSeq 技术，成功克隆了多个小麦抗病基因。但捕获阵列可能遗漏目标基因，且并非所有抗病基因都是 NLR 类基因。
染色体流分选也是降低小麦基因组复杂性的策略之一。Sánchez-Martín 等人利用 EMS 诱变结合染色体流分选和 Illumina 短读长测序（MutChromSeq）克隆了白粉病抗性基因 Pm2a。该方法对携带目标基因的染色体进行流分选和测序，比对突变体与野生型序列确定候选基因。MutChromSeq 还成功克隆了 Pm4a、Rht18 等多个基因，但该技术应用存在一定限制，要求染色体大小或 GAA 含量有显著差异。
RNA 测序同样可降低基因组复杂性，因为小麦编码序列仅占基因组的 1% 多一点。MutRNASeq 方法通过对突变体 RNA 测序克隆基因，如 Yu 等人用该方法克隆了 Sr62 抗性基因，Li 等人克隆了 Lr47 和 Pm69 抗性基因。此外，MutIsoSeq 和 STAM（测序性状相关突变）两种相似方法，利用野生型亲本的异构体测序（PacBio Iso-seq）和 EMS 突变体的深度 RNA 测序，分别成功克隆了小麦叶锈病抗性基因 Lr9/Lr58 和 YrNAM。这些方法成本较低，可快速识别候选基因，但得到的是转录本序列，还需生成基因的基因组序列。
GWAS——QTL 定位的替代方法
全基因组关联研究（GWAS）是替代标准双亲 QTL 定位的有效方法，它利用自然群体中积累的历史重组事件检测 QTL，无需构建双亲群体。对选定的包含数百个个体的自然群体进行高通量基因分型，根据标记在参考基因组序列中的位置排序。关联分析可确定与测试性状变异相关的标记或连锁不平衡（LD）块的基因组位置，为基因克隆提供理想基础。Arora 等人利用 k - mer 关联映射与 RenSeq 结合的 AgRenSeq 方法，从野生近缘种节节麦中发现了多个抗病基因。Gaurav 等人应用改进的 k - mer 关联映射流程，成功鉴定并克隆了节节麦中的茎锈病和白粉病抗性基因。
候选基因的功能验证
功能验证是基因克隆的最后一步，用于确认候选基因与目标性状的关系。可采用正向或反向遗传学方法。正向遗传学验证包括诱变筛选功能缺失突变体，或通过对大量表型不同的种质进行关联映射提供间接证据。
反向遗传学则需构建重组 DNA 构建体，调控目标基因的表达、下调或敲除。将候选基因或其片段克隆到表达载体中，通过基因枪轰击或农杆菌介导的渗透法导入植物细胞。但许多植物品种对农杆菌感染有抗性，影响转化效率，不过通过改造农杆菌可提高转化效率。在小麦中，稳定转化和瞬时转化都可用于候选基因验证。稳定转化需将转基因植株从幼胚培养成成年植株，但再生效率低限制了可转化基因型数量。过表达植物发育调节基因可提高再生效率。瞬时转化在幼苗或叶片组织上进行，不涉及外源基因永久整合，可用于短期基因表达，能快速预筛选多个候选基因。此外，在模式生物中异位表达也是功能验证的一种选择。
小麦候选基因验证的传统反向遗传学方法包括瞬时基因表达、将候选基因转化到表型差异的背景中、RNA 干扰（RNAi）介导的稳定或瞬时下调、病毒诱导基因沉默（VIGS）介导的瞬时下调等。如今，基因组编辑技术如转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）和规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 也可用于候选基因验证。CRISPR/Cas9 因设计简单、构建体小、可同时靶向多个位点或基因等优势，逐渐取代 TALEN 技术。
结论
过去二十年，分子技术和基因组学的进步显著改变了小麦基因克隆研究。小麦基因组序列的可用性、下一代测序技术的发展，促进了图谱克隆，催生了基于诱变等新方法。成功克隆的小麦基因数量大幅增加，不同克隆方法各有优劣。基于同源性的克隆适用于有多个直系或旁系同源物的基因，但局限于已知物种中的同源基因；图谱克隆可用于克隆单拷贝基因，但在重组抑制区域存在挑战；诱变克隆能直接识别候选基因，适合克隆抗病等表型差异明显的基因；GWAS 可快速识别候选基因，但对群体结构和大小有要求，易遗漏稀有变异基因。多种方法的出现为克服小麦复杂基因组带来的挑战提供了途径，基因克隆效率不断提高，将持续推动小麦遗传改良。
