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这篇综述聚焦于病毒感染性克隆技术，详细阐述了基于酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）及二者结合（YAC-BAC）平台构建感染性克隆的机制、优势与挑战，还介绍了其在疫苗开发、抗病毒药物筛选等多领域的应用，为相关研究提供重要参考。
引言
DNA 合成技术的突破为众多领域带来新机遇，合成基因组学应运而生，其对病毒反向遗传学产生了重要影响，推动了疫苗设计与生产。反向遗传学可通过病毒的 cDNA 克隆拯救活病毒，而感染性克隆作为反向遗传学的核心，是实验室构建的病毒 DNA 拷贝，能在导入宿主细胞后产生有感染性的病毒粒子。目前已成功拯救多种病毒的感染性克隆，构建方法多样，其中 YAC 和 BAC 技术应用广泛。感染性克隆技术在生物医学领域发挥着关键作用，如在 COVID-19 研究中，助力快速检测病毒、开发疫苗等。本综述旨在深入探讨基于 YAC、BAC 和 YAC-BAC 技术构建感染性克隆的机制、策略，以及其在多领域的应用，为该技术的发展提供参考。
酵母人工染色体重组技术
1. YAC 系统的机制与发展
1983 年，Murray 和 Szostak 将酵母关键元件（着丝粒 CEN4、自主复制序列 ARS1 和端粒类似序列 Tr）整合到大肠杆菌 pBR322 质粒中，开启了 YAC 技术。YAC 主要基于酵母的同源重组系统，该系统在 DNA 双链断裂修复、片段连接等过程中发挥作用，其准确性和效率由一系列 Rad 蛋白介导。在此基础上发展的转化相关重组（TAR）技术，依赖于重叠序列的长度和特异性等因素。TAR 载体包含 YAC 和 BAC 盒，可在酵母和细菌中稳定复制和表达基因，其两端的 “钩子” 序列能引导目标片段精确插入，较短的重叠序列（如 15bp）即可促进同源重组，30bp 重叠序列可保证较高成功率。
2. YAC 技术在病毒基因组学中的优势
YAC 可容纳大 DNA 片段（200 - 500kb，甚至可达 1Mb），且无病毒 DNA 限制位点，能完整封装病毒基因组，同时避免了重组病毒繁琐的噬菌斑纯化步骤。TAR 技术借助同源重组，可精确分离和重组基因，实现一步法基因组组装，减少对限制性酶切位点的依赖，提高克隆精度，已成功应用于多种病毒感染性克隆的构建。
3. YAC 技术面临的挑战
使用 TAR 构建感染性病毒克隆存在诸多挑战。DNA 修复机制（如非同源末端连接 NHEJ 和微同源介导的末端连接 MMEJ）会影响 TAR 的效率，高 GC 含量和 UV 处理等因素也会降低酵母重组效率。酵母质粒提取复杂、耗时，且产量低、纯度不高，难以满足转染需求。此外，YAC 技术需通过体外转录生成病毒 RNA 基因组，T7 和 SP6 聚合酶转录错误率较高，且 RNA 转染效率低于 DNA，这些问题都有待优化。
4. 利用 YAC 技术开发的病毒感染性克隆实例
1994 年，约翰霍普金斯大学的研究人员利用 YAC 技术成功构建了人类腺病毒 2 型（HAdv 2）的感染性克隆。此后，TAR 技术不断发展，在多种病毒研究中发挥重要作用。如 Thao 等人利用 TAR 技术在一周内重建了 SARS-CoV-2 基因组，通过 RT-PCR 和化学合成扩增病毒基因组 cDNA，分段后与线性化 TAR 载体共转化到酵母细胞中，利用酵母同源重组机制组装成全基因组，再经体外转录和转染等步骤成功拯救出病毒，并插入 GFP 报告基因进行研究。不过，使用 TAR 技术时需对酵母质粒进行测序，以确保无意外突变。
细菌人工染色体重组技术
1. BAC 系统的机制与发展
BAC 载体最初由 Shizuya 等人于 1992 年开发，其原型 pBAC108L 整合了大肠杆菌的 F 因子（包含复制和分配基因 oriS、repE，以及分区蛋白基因 parA、parB 和氯霉素抗性基因 CMR）。为解决原构建体中重组选择标记缺失的问题，研究人员添加了 lacZ 基因片段，开发出 pBeloBAC11，其能稳定支持外源病毒序列，在冠状病毒和疱疹病毒研究中应用广泛。近年来，新的 BAC 系列载体不断涌现，如增强选择标记的 BAC 载体、含报告基因的 BAC 载体以及高拷贝复制的 BAC 载体等，推动了合成基因组学的发展。
2. BAC 技术在病毒学中的优势
BAC 能稳定维持低拷贝数，可容纳 150 - 350kb 的 DNA 片段，减少嵌合异常和结构重排的发生，可作为自我复制单元容纳完整病毒 cDNA。此外，CMV 立即早期启动子的引入，使病毒 RNA 能在靶细胞内直接合成，无需体外转录。
3. BAC 技术面临的挑战
基于 BAC 的反向遗传学技术存在一些问题。在细胞培养中拯救病毒时，可能诱导病毒基因组适应性突变，影响其遗传完整性；传统筛选方法可能导致选择偏倚，难以直接从临床样本中克隆病毒基因组。病毒重复序列会导致 BAC 克隆在大肠杆菌中扩增时出现表型差异，寻找合适的限制性酶切位点困难，组装的基因组不稳定，同源重组可能引入突变，且每次基因组修饰都需顺序进行，实验周期长。对于 RNA 病毒，其 cDNA 对大肠杆菌可能有毒性，需采取相应策略降低毒性，同时在实验各阶段都需严格验证质粒中的病毒序列，防止突变。
4. 利用 BAC 技术开发的病毒感染性克隆实例
1997 年，Messerle 等人首次利用 BAC 技术构建了小鼠巨细胞病毒（MCMV）的全长感染性克隆，通过同源重组将 pKSO 载体和 gpt 选择标记整合到病毒非必需区域，在大肠杆菌中克隆筛选后，转染到真核细胞中拯救出重组病毒，该方法便于引入多个突变。此后，BAC 技术在疱疹病毒研究中广泛应用，已成功构建多种动物疱疹病毒和人类疱疹病毒（除人类疱疹病毒 7 外）的感染性克隆。在冠状病毒研究中，2000 年 Almazan 等人首次利用 BAC 构建了传染性胃肠炎病毒（TGEV）的感染性克隆，后续又成功构建了严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）等多种冠状病毒的感染性克隆，推动了冠状病毒的研究。
联合 YAC-BAC 重组技术
1. 联合 YAC-BAC 系统
YAC 和 BAC 常作为独立技术构建感染性病毒克隆，随着酵母 - 细菌穿梭载体的发展，YAC-BAC 联合方法应运而生。该方法结合了酵母高效同源重组和大肠杆菌复制操作的优势，适用于研究复杂基因组、构建基因组文库和工程化大型病毒基因组。YAC 可在酵母细胞中维持和繁殖更大的基因组 DNA 片段（可达 2Mb），而 BAC 在细菌宿主中容纳的片段稍小（可达 300Kb），二者在关键元件、质粒等方面存在差异，研究人员可根据项目需求选择合适的技术。
YAC-BAC 方法基于 TAR 原理，利用 RNA 聚合酶 II 的反向遗传学拯救系统，在病毒基因组 5’端添加 CMV 启动子，避免了体外转录或使用 T7 聚合酶表达细胞系的需求。将病毒基因组设计成多个重叠片段，与 YAC-BAC 穿梭载体连接后导入酵母细胞，利用酵母高效的 DNA 摄取和同源重组能力进行组装和整合，通过筛选标记选择含有病毒基因组的酵母克隆，提取重组酵母质粒后导入大肠杆菌进行扩增，经测序验证后用于病毒拯救。目前已开发出多种 YAC-BAC 穿梭载体，如 pCC1BAC-His3、pGF 和 pYES1L 等，在多种病毒研究中发挥了重要作用。
2. YAC-BAC 在复杂病毒基因组中的应用
YAC-BAC 方法结合了 YAC 和 BAC 的优点，避免了酵母质粒提取的复杂步骤，解决了部分病毒序列对大肠杆菌的毒性问题，采用更简单稳定的 mRNA 转染方法进行病毒拯救，无需限制性内切酶。该方法已成功应用于多种病毒感染性克隆的构建，如在黄病毒研究中，Polo 等人于 1997 年利用 YAC-BAC 方法构建了登革热病毒 2 型（DEN2 NGC）的感染性克隆；在冠状病毒研究中，Nikiforuk 等人于 2016 年构建了 MERS-CoV 的感染性克隆，Tan 等人开发了构建 HCoV-OC43 VR1558 株感染性克隆的简化方法；在动物冠状病毒研究中，Zhou 等人构建了 GII 型猪流行性腹泻病毒（PEDV）的感染性克隆；在疱疹病毒研究中，Oldfield 等人构建了 HSV-1 KOS 株的感染性克隆，Knickmann 等人利用单步 YAC-BAC 方法拯救了大鼠巨细胞病毒（RCMV）和卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV/HHV-8）；在杆状病毒研究中，Shang 等人成功合成并拯救了杆状病毒 Autographa californica nucleopolyhedrovirus（AcMNPV）。这些研究表明，YAC-BAC 方法在病毒研究领域具有广泛的应用前景，但目前其应用主要集中于大型 DNA 病毒和正链单链 RNA 病毒，对负链 RNA 病毒的研究较少，且存在宿主相关的局限性，有待进一步改进。
病毒感染性克隆在病毒学中的应用
1. 疫苗开发
疫苗种类多样，包括减毒活疫苗（LAVs）、灭活疫苗、病毒载体疫苗等。反向遗传学技术通过定点突变修饰病毒基因组，可精确减弱病毒致病性，缩短减毒活疫苗的制备时间，提高疫苗稳定性。如 Vashee 等人利用 TAR 方法组装人巨细胞病毒（HCMV）Toledo-P 株，Menachery 等人删除 MERS-CoV 的非结构蛋白 ORF5，Ye 等人删除 SARS-CoV-2 的 ORF3a 和 ORF7b，这些研究均表明反向遗传学技术在疫苗开发中的重要作用。此外，体内反向遗传学直接从动物模型中拯救病毒，结合了减毒活疫苗和 DNA 疫苗的优点，为疫苗开发提供了新策略。
2. 抗病毒药物发现
病毒感染威胁人类健康，传统抗病毒药物筛选方法存在局限性。反向遗传学技术使报告基因和复制子成为高通量筛选抗病毒药物的重要工具。报告基因在病毒学研究中广泛应用，可直观评估疫苗和药物效果。病毒复制子因缺乏结构蛋白，不能产生感染性病毒粒子，是研究高致病性病毒复制和筛选抗病毒药物的安全工具。研究人员构建了多种病毒复制子系统，如基于 BAC 方法构建的 SARS-CoV-2 荧光报告基因复制子，以及稳定表达报告基因的细胞系等，用于评估抗病毒药物的药效，但目前仍面临一些挑战，如单周期复制子系统操作繁琐、RNA 复制子对细胞有毒性等。
3. 发病机制和毒力研究
感染性克隆可通过人工合成或修饰病毒基因组，观察遗传改变对病毒生物学特性的影响，揭示病毒的致病和突变机制。在冠状病毒研究中，Ogando 等人通过 BAC 技术研究 MERS-CoV nsp14 重组病毒，发现 nsp14 的 ExoN 外显子在病毒复制中起重要作用；研究人员还通过构建重组病毒，对 TGEV、PEDV、FCoV 等冠状病毒的关键蛋白进行研究，为疫苗开发提供了新见解。在其他 RNA 病毒研究中，如 ZIKV 和轮状病毒，感染性克隆也被用于研究病毒的发病机制和毒力。
4. 基因治疗和载体设计
溶瘤病毒免疫疗法在癌症治疗中备受关注，溶瘤病毒可分为天然肿瘤选择性病毒和基因工程病毒，通过直接裂解肿瘤细胞和激活抗肿瘤免疫反应发挥作用。HSV-1 和麻疹病毒等已被应用于溶瘤病毒研究，如 G207 和 G47?等 HSV-1 衍生的溶瘤病毒已进入临床试验阶段，rMeV Hu191 重组麻疹病毒在乳腺癌治疗中展现出潜力。此外，合成生物学的发展使多种病毒被改造为病毒载体，如腺病毒载体在疫苗开发中应用广泛，研究人员还构建了多种重组腺病毒疫苗，为传染病防治提供了新手段。
病毒感染性克隆技术面临的挑战和未来方向
1. 技术限制
在构建和应用病毒感染性克隆时，存在技术挑战。获取模板片段时可能出现基因序列保真度问题，可通过优化 PCR 条件和采用逐步合成方法解决；在宿主细胞中组装全长 cDNA 时易发生突变，需采用合适方法检测和验证；不同的构建策略、外源基因选择和修饰位点会影响重组病毒的稳定性和生物学特性，需在设计阶段谨慎考虑。此外，对感染性克隆进行基因组修饰仍较繁琐，CRISPR-Cas 等技术可用于直接修饰感染性克隆，但在 RNA 病毒应用中存在脱靶效应，不过结合 YAC 和 BAC 的从头合成技术为 RNA 病毒研究带来了新希望。
2. 未来进展
合成生物学的发展推动了病毒学研究，高保真聚合酶和不断改进的载体减少了构建感染性克隆的限制。SARS-CoV-2 的爆发加速了新兴技术的发展，如 CPER 和 ISA 等 PCR - 基于的方法可快速操作病毒基因组，但仍存在病毒拯救效率低、需要病毒传代和序列确认等问题。YAC、BAC 和 YAC-BAC 技术应用广泛，YAC-BAC 技术为大型和高致病性病毒研究提供了新途径，有望成为其他病毒研究的通用平台，但目前在负链 RNA 病毒研究中的应用有待拓展。
3. 伦理和监管考虑
感染性克隆技术引发了对合成生物和病毒潜在环境释放的担忧。自首个合成 DNA 基因组诞生以来，生物伦理和生物安全问题备受关注。美国卫生与公众服务部发布了商业基因合成指南，众多委员会和审查小组也讨论了相关问题并提出监管建议。研究人员应采取措施，如在合成基因组中加入水印、限制合成生物的生存能力等，以降低风险。
