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为解决细菌基因功能认知不足，难以精准识别抗生素应激下关键基因的问题，研究人员开展了利用高密度 sgRNA 文库对大肠杆菌进行全基因组 CRISPRi 筛选的研究。结果发现了关键耐药基因，揭示了耐药机制。这为抗菌研究提供了新方向。
在微生物的世界里，细菌就像一群 “狡猾” 的小生命，它们拥有着强大的适应能力，能在各种环境中顽强生存。尤其是面对抗生素的 “攻击” 时，细菌常常能巧妙应对，产生耐药性，这给人类的健康带来了巨大挑战。目前，虽然我们知道细菌可以通过获取和优化基因来适应环境，但对于基因在应对抗生素应激时的具体功能，我们的了解还十分有限。传统研究基因功能的方法，比如基因敲除和转座子介导的基因失活，虽然在一定程度上有帮助，但它们也存在明显的不足，很难检测出那些对细菌生存重要但并非不可或缺的基因。而转录组分析虽然能研究细菌对抗生素的反应，但也只能发现已知的对抗生素应激有反应的基因，无法提供更全面的视角。正因如此，深入探究细菌在抗生素应激下的基因适应机制迫在眉睫。
为了攻克这一难题，来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）和韩国科学技术院（Korea Advanced Institute of Science and Technology）等机构的研究人员，展开了一项极具创新性的研究。他们利用全基因组 CRISPRi 筛选技术，结合高密度的单导向 RNA（sgRNA）文库，对大肠杆菌（Escherichia coli）进行了深入研究。这项研究成果发表在《iScience》杂志上，为我们理解细菌的抗生素耐药机制带来了新的曙光。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。其中，CRISPRi（clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference，成簇规律间隔短回文重复序列干扰）技术是核心。它能够通过转录抑制来研究基因的必要性，而无需破坏基因本身。研究人员设计并构建了一个高密度的 sgRNA 文库，该文库可以靶向大肠杆菌 K - 12 MG1655 的整个编码序列（CDS）。同时，他们还使用了下一代测序技术（NGS），通过监测 sgRNA 群体在不同抗生素处理下的变化，来量化基因的适应性效应。
下面来详细看看研究结果：
- 全基因组基因敲低的适应性效应：研究人员采用 CRISPRi 系统研究基因敲低对大肠杆菌 K - 12 MG1655 的适应性影响。他们设计合成了覆盖大肠杆菌 4198 个编码序列（CDS）、靶向 39591 个位置的 sgRNA 文库，并将其转化到表达 dCas9 的大肠杆菌中培养。通过测量 sgRNA 丰度，使用富集比（ER）来量化适应性效应。结果发现，非必需基因的 ER 值（中位数 0.989）远高于必需基因（中位数 0.346），这表明 ER 能准确反映基因敲低的适应性效应。而且，sgRNA 的位置对抑制效果没有显著影响，CRISPRi 的抑制活性在基因的不同位置都保持一致。
- 大肠杆菌对多种抗生素处理的普遍反应：通过主成分分析（PCA）研究人员发现，大肠杆菌对不同作用方式的抗生素有不同的反应。在分析中，他们确定了 1085 个基因敲低会在抗生素处理下导致显著的适应性差异。其中，有 7 个基因在 10 种以上抗生素处理下 ER 值发生显著变化。例如，degP、yacG 和 ybbC 基因敲低会产生有害的适应性效应，说明它们在对抗生素中起保护作用；而 yjiG、rmlE、yebO 和 yoaC 基因敲低则有益，表明它们的正常功能在抗生素暴露下对细菌生存不利。此外，外膜通道 TolC 在多种抗生素处理下 ER 值降低，显示出其在细胞防御中的重要作用。
- CRISPRi 筛选揭示抗生素作用的特定细胞靶点：
- 对产生活性氧物质抗生素的反应：以绿脓菌素（pyocyanin）为例，它通过产生活性氧物质（ROS）发挥抗生素作用。CRISPRi 筛选发现，氧化还原响应的双组分系统 SoxRS 和 ArcAB 的 ER 值显著下降，铁 - 硫系统相关基因以及泛醌生物合成基因的 ER 值也降低，而谷胱甘肽和谷胱甘肽亚精胺生物合成基因的表达降低则使菌株在绿脓菌素处理下富集。这揭示了绿脓菌素作为抗生素的分子机制。
- 对氧化磷酸化抑制抗生素的反应：CCCP（carbonyl cyanide 3 - chlorophenylhydrazone，羰基氰 3 - 氯苯基腙）是一种氧化磷酸化抑制剂。它对参与电子传递链的基因影响显著，如 NADH 脱氢酶 I、琥珀酸脱氢酶等。同时，研究还发现了一个可能参与排出 CCCP 的 ABC 转运体，以及预测的小膜蛋白 YoaI，其 ER 值变化显著。此外，hpf（核糖体休眠促进因子）、sapA（周质结合蛋白）和 sapBCF（腐胺 ABC 转运体亚基）的敲低在 CCCP 处理下对生存有益。
- 对具有阳离子洗涤剂作用抗生素的反应：多粘菌素 B（polymyxin B）处理主要导致与维持外膜完整性相关基因的敲低被耗尽，如参与脂多糖（LPS）核心生物合成、BAM 复合物、外膜磷脂酶 A 和 Tol - Pal 复合物的基因。这表明这些基因在应对多粘菌素 B 时至关重要。
- 对转录抑制剂抗生素的反应：利福平（rifampicin）处理导致 160 个基因的 ER 值发生变化，其中看家 sigma 因子 RpoD 和核糖核酸酶 E 抑制剂 RraA 变得更加必需，Sap 转运体在利福平处理下 ER 值增加。
- 对叶酸生产抑制抗生素的反应：磺胺甲恶唑（sulfamethizole）抑制叶酸合成。研究发现，参与叶酸合成途径中蝶呤合成的基因 ER 值显著下降，而参与对氨基苯甲酸（pABA）合成的基因不受影响，FolD 基因敲低在磺胺甲恶唑存在下具有有益效果。
- 对钙通道阻滞剂抗生素的反应：维拉帕米（verapamil）处理影响了大肠杆菌的膜磷脂转运、Tol - Pal 系统、Sec 蛋白转运系统和 Tat 系统，但 yajC 基因敲除突变体与野生型在维拉帕米诱导的生长抑制方面表现相似。
- 对 DNA 损伤剂的反应：在 DNA 损伤剂处理下，rpoS 和 yacG 基因变得更加必需，谷氨酸消旋酶（MurI）和参与肽聚糖生物合成的基因 ER 值也发生显著变化，同源重组修复基因 recO 和 recA 在部分 DNA 损伤剂处理下 ER 值降低。
- 对翻译抑制剂的反应：红霉素（erythromycin）和嘌呤霉素（puromycin）处理时，蛋白酶 DegP 和 Lon 的 ER 值显著改变，UDP - 3 - O - 酰基 - N - 乙酰葡糖胺脱乙酰酶（LpxC）在应对翻译抑制剂时也很关键，辅助因子在不同翻译抑制剂处理下表现出不同反应。
综合研究结果和讨论部分，这项研究具有重大意义。它展示了全基因组 CRISPRi 筛选在研究细菌对抗生素反应方面的强大能力，不仅揭示了大肠杆菌对多种抗生素的遗传反应，包括普遍应激反应和特定抗生素处理相关的生物学过程，还发现了许多之前未被认识到的参与抗生素应激反应的基因。这为我们理解细菌的抗生素耐药机制提供了更深入的视角，有助于识别潜在的抗生素靶点和开发新的抗菌策略。同时，该研究也存在一定局限性，如 CRISPRi 只能关注转录抑制，无法诱导沉默基因表达。未来可结合 CRISPR 激活（CRISPRa）技术，进一步深入研究细菌在抗生素应激下的基因调控机制。
