单细胞测序揭示复发 T 细胞急性淋巴细胞白血病免疫微环境及 JUN 介导的 NK 细胞耗竭机制

这篇研究利用单细胞转录组分析，描绘了 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者骨髓免疫微环境，发现复发 T-ALL 患者存在严重免疫抑制，NK 细胞耗竭，JUN 是关键因素。JUN 抑制剂可改善 NK 细胞耗竭并抑制白血病细胞，为复发 T-ALL 免疫治疗提供新方向。

　　

研究背景

T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是一种起源于造血干细胞（HSCs）的恶性克隆性疾病，在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）中约占 15%，在成人 ALL 中占 25%。其发病机制尚未完全明确，预后较 B 细胞 ALL（B-ALL）差，约 40% 的成人和儿童 T-ALL 患者在病程中会出现耐药或复发，5 年生存率低于 7%。

免疫疗法，如嵌合抗原受体（CAR）疗法，旨在增强 T 细胞和自然杀伤（NK）细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，但部分患者仍会复发。NK 细胞在肿瘤防御中具有重要作用，它无需抗原致敏，不受主要组织相容性复合体（MHC）限制，可通过释放细胞毒性细胞因子和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）作用直接杀伤肿瘤细胞。NK 细胞根据 CD56 表达可分为 CD56^bright_NK 细胞和 CD56^dim_NK 细胞两个亚群，它们在免疫反应中发挥不同功能。

JUN 是激活蛋白 1（AP-1）亚家族的转录因子，对免疫反应、细胞生长、增殖和发育有重要影响。在多种癌症中，JUN 表达升高，但它在 NK 细胞中的作用存在争议。

传统的批量测序无法揭示细胞亚群动态，而单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）可详细分析组织混合物中单个细胞的基因组或转录组，有助于深入了解 T-ALL 细胞的异质性。目前，T-ALL 免疫细胞耗竭与复发的关系以及复发患者免疫细胞亚群的特征仍不明确。本研究通过对 T-ALL 患者骨髓进行 scRNA-seq 分析，旨在绘制免疫微环境图谱，分析 T 细胞受体（TCR）库，鉴定 CD4⁺ T 细胞亚群，确定导致 NK 细胞耗竭的关键分子，并探索潜在的免疫治疗策略。

研究结果

1. 复发 T-ALL 患者肿瘤免疫微环境（TIME）存在严重免疫抑制：对 3 名健康供体（HDs）、3 名原发性 T-ALL 患者和 3 名复发 T-ALL 患者的样本进行单细胞转录组分析，共检测了 49,892 个优质免疫细胞。通过 Seurat 和 SingleR 等方法确定了 13 种主要细胞类型，包括 B 细胞、CD14⁺单核细胞、CD16⁺单核细胞、CD4⁺ T 细胞、CD8⁺ T 细胞等。UMAP 图显示，T-ALL 患者与 HDs 的免疫细胞分布和比例存在差异，复发 T-ALL 患者的 T 淋巴细胞（CD4⁺ T 细胞和 CD8⁺ T 细胞）、NK 细胞和 γδT 细胞减少，而 HSCs 和粒细胞 - 单核细胞祖细胞（GMPs）扩增。此外，T-ALL 患者，尤其是复发患者，CD4/CD8 比值降低，提示免疫抑制。利用 Monocle 2 进行伪时间分析发现，复发 T-ALL 患者的原始细胞（如 HSCs 和 GMPs）显著增加。
2. 恶性 T-ALL 细胞与正常 HSCs 的相互作用：研究利用机器学习分类器和 inferCNV 方法，发现恶性 T-ALL 细胞可能与 HSCs 共聚集，HSC 簇的拷贝数变异（CNV）水平较高。对 HSC 细胞群体进行无监督聚类，鉴定出 6 种不同类型的 HSCs，并通过伪时间分析揭示了其分化轨迹。
3. JUN 介导复发 T-ALL 患者 NK 细胞耗竭并维持 T-ALL 增殖：在 T-ALL 患者中，NK 细胞的比例和数量均低于 HDs，且复发 T-ALL 患者的 NK 细胞中 TIGIT、LAG3 和 KLRC1 等免疫检查点分子水平较高，表明 NK 细胞耗竭更明显。对 NK 细胞进行重新聚类分析，发现 JUN 是复发 T-ALL 患者 NK 细胞中上调最显著的基因之一。KEGG 富集分析显示，复发 T-ALL 患者 NK 细胞中与 PD-L1 表达、PD-1 检查点通路、造血系统疾病、人类 T 细胞白血病病毒 1 感染和免疫系统疾病相关的通路富集。此外，JUN 在复发 T-ALL 患者的 NK 细胞和 HSC 簇中高表达，提示其在 NK 细胞耗竭和肿瘤细胞增殖中的重要作用。
4. T 细胞重新聚类和亚群鉴定：对 CD4⁺ T 细胞进行重新聚类，根据已知的经典标记将其分为 6 个亚群，包括 CD4⁺幼稚 T 细胞、Th1 细胞、Th2 细胞、调节性 T 细胞等，并发现了两个新的亚群：ANXA1^?GATA3^?CD4⁺ T 细胞和 ANXA1⁺GATA3⁺CD4⁺ T 细胞。对 CD8⁺ T 细胞重新聚类得到 4 个主要亚群，包括 CD8⁺_Naive T 细胞、效应 T 细胞（CD8_Teff）等。通过伪时间分析，揭示了 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞亚群的发育轨迹。此外，研究还发现复发 T-ALL 患者多种 T 细胞亚群数量明显减少，且不同 T 细胞簇的基因表达模式存在相似性。
5. TCR 库分析显示复发 T-ALL 患者 T 细胞发生显著改变：分析复发 T-ALL 患者的 TCR 库，发现 CD8⁺ T 细胞克隆比 CD4⁺ T 细胞多，这些 CD8⁺ T 细胞克隆参与了多种与免疫相关的通路。MAIT 细胞的克隆扩增较少，而 CD8_Naive 和 CD8_Teff 细胞簇的克隆扩增分别有限和较强。Pearson 相关性分析表明，CD8_Teff 和 GZMK_CD8⁺ T 细胞之间存在密切的克隆型关系，提示它们可能具有共同的谱系。
6. 复发 T-ALL 患者的 NK 细胞耗竭：通过对 T-ALL 患者和 HDs 的骨髓样本进行流式细胞术分析，发现复发 T-ALL 患者耗竭的 NK 细胞比例更高，且 JUN 在 T-ALL 患者中高表达，在复发患者中表达更高。对复发 T-ALL 患者来源的肿瘤异种移植（PDX）模型进行 scRNA-seq 分析，发现随着治疗进展，NK 细胞数量先增加后减少，且在 T-ALL 细胞再次增加时，NK 细胞严重耗竭。
7. JUN 抑制剂减轻 T-ALL PDX 小鼠模型的白血病负担：建立 T-ALL PDX 模型，评估 JUN 抑制剂 JNK-IN-8 的疗效和毒性。结果表明，JNK-IN-8（10 mg/kg）联合化疗可显著减少白血病细胞，延长小鼠生存时间，且该剂量的 JNK-IN-8 毒性较低。对另一个 T-ALL PDX 模型的研究也得到了类似结果，证实了 JUN 抑制剂在体内的抗白血病作用。
8. JUN 抑制剂显著降低 T-ALL 小鼠细胞来源的肿瘤异种移植模型的白血病负担：建立 T-ALL 细胞来源的肿瘤异种移植（CDX）模型，发现 JNK-IN-8 和化疗均能显著降低肿瘤负担，延长小鼠生存时间，联合治疗效果更显著。此外，JNK-IN-8 联合化疗可促进 T-ALL 细胞凋亡，进一步验证了 JUN 抑制剂的治疗潜力。
9. JUN 抑制剂抑制 NOTCH1 突变的 T-ALL 小鼠的白血病细胞，增强 NK 细胞群体并防止 NK 细胞耗竭：建立 NOTCH1 突变的 T-ALL 小鼠模型，发现 JNK-IN-8 治疗可显著减少外周血 GFP⁺细胞，增加 NK 细胞比例，减少耗竭的 NK 细胞。RNA 测序分析表明，JUN 抑制剂可能通过 PD-1/PD-L1 免疫检查点和 NK 细胞介导的细胞毒性等途径诱导 T-ALL 细胞死亡，减少 NK 细胞耗竭。
10. JUN 抑制剂联合 PD-1 免疫检查点阻断可协同抑制 T-ALL 小鼠的白血病细胞并防止 NK 细胞耗竭：在 NOTCH1 突变模型中，联合使用 JNK-IN-8 和抗 PD-1 抗体治疗，发现该联合治疗可协同靶向 T-ALL 肿瘤细胞，延长小鼠生存时间，增加 NK 细胞数量，减少耗竭的 NK 细胞比例，表明联合治疗具有协同效应，可增强 NK 细胞介导的抗肿瘤免疫。
11. JUN 抑制剂抑制 T-ALL 细胞增殖并防止 NK 细胞耗竭：通过 MTS 和集落形成实验，发现 JNK-IN-8 可显著抑制 MOLT-4 细胞的活力和集落形成能力。Annexin V/PI 双染和 Western blot 分析表明，JNK-IN-8 可诱导 T-ALL 细胞凋亡。此外，与 MOLT-4 细胞共培养的实验表明，JNK-IN-8 可减轻 NK-92 细胞的耗竭，提示抑制 JUN 功能不仅可抑制 T-ALL 细胞增殖，还可防止 NK 细胞耗竭。

研究讨论

本研究利用 scRNA-seq 技术对 T-ALL 患者的 TIME 进行了全面分析，鉴定了 13 个关键细胞簇，重新聚类了 HSCs、T 细胞和 NK 细胞，并发现了两个 CD4⁺ T 细胞亚群。研究确定 JUN 是导致 NK 细胞耗竭的关键分子，且对 T-ALL 中 HSC 的增殖至关重要。通过多种小鼠模型，证实了 JUN 在 T-ALL 生存和 NK 细胞耗竭中的作用。

HSCs 在维持血液系统稳定中起重要作用，但在复发 T-ALL 患者中，HSCs 数量增加且可能具有白血病干细胞特性。NK 细胞在抗肿瘤免疫中具有重要作用，然而在 T-ALL 中，NK 细胞数量减少且功能耗竭，与 JUN 表达升高有关。抑制 JUN 功能可抑制 T-ALL 细胞生长，恢复 NK 细胞的细胞毒性，JUN 可能是复发 T-ALL 的潜在治疗靶点。

此外，本研究还发现复发 T-ALL 患者 T 细胞数量减少，鉴定出的两个 CD4⁺ T 细胞亚群在免疫调节中可能具有重要作用。TCR 库分析揭示了 T 细胞在复发 T-ALL 中的显著变化。这些结果为深入理解 T-ALL 复发机制提供了新视角，为开发针对复发 T-ALL 的创新免疫疗法奠定了基础。

研究局限性

本研究存在一些局限性。由于患者样本有限，对 JUN 调节 NK 细胞耗竭的机制研究不够深入，需要进一步研究来证实相关发现。此外，本研究使用的模型为短期模型，无法监测治疗停止后疾病的复发情况，应进行更长时间的监测。最后，JNK-IN-8 联合化疗或 PD-1 抗体的协同治疗效果需要在临床试验中进一步验证。