环状刷状球形核酸：通过调节中性粒细胞极化开启肝癌基因免疫治疗新征程

这篇研究构建了基于 miR - 122 的环状刷状球形核酸（SNA）纳米平台用于肝癌治疗。该平台能绕过免疫抑制微环境，促进中性粒细胞极化激活抗肿瘤免疫，在小鼠模型中肿瘤抑制率达 87.4% ，为肝癌基因免疫治疗提供新策略。

　　

研究背景

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常见的恶性肿瘤，5 年相对生存率仅 21% 。多数患者确诊时已处于中晚期，且 HCC 存在严重的免疫抑制，单一治疗策略难以有效治疗。肝特异性内源性 microRNA - 122（miR - 122）在肝癌发生发展等过程中起关键作用，虽可调节靶基因和信号通路影响肝癌发生，还能激活肝细胞先天免疫，但基于 miR - 122 的基因治疗常需与其他策略联合以提高疗效，且联合治疗存在配方设计复杂、制备步骤多等问题，不利于规模化生产和临床转化。

随着精准医学时代到来，基因治疗备受关注，但安全高效的基因递送载体体内转化仍是难题。可生物降解的球形核酸（Spherical nucleic acids，SNAs）是一类新型核酸，其核酸壳能防止核酸被核酸酶降解，增强细胞外稳定性，且可无需转染试剂进入细胞，避免相关不良反应。与无机核心 SNA 相比，聚合物核心 SNA 生物相容性更好、有更多修饰位点且负载能力可调节。此前开发的共递送阿霉素（DOX）和 miR - 122 的 SNA 纳米平台激活的先天免疫反应仍不足，如何通过简单有效策略增强 miR - 122 的先天免疫激活特性成为挑战。受环状精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸（cRGD）肽靶向性和环状 mRNA 稳定性启发，研究团队推测构建基于 miR - 122 的环状刷状 SNA 纳米平台，或可增强 miR - 122 的先天免疫激活特性，用于肝癌的基因免疫治疗。

实验设计

研究通过点击化学将带有叠氮二苯并环辛炔 - 胺（DBCO）末端的游离 miR - 122 链与优化后的带有悬垂叠氮基团的环状聚（2 - 羟乙基甲基丙烯酸酯）（c - P (HEMA)）核心结合，制备出环状刷状 miR - 122（cb - P (HEMA - miR - 122)），其可进一步自组装成 SNA。对 SNA 的构建进行优化，并通过全面的体外和体内研究评估所得 cb - miR - 122 SNAs 的抗肿瘤特性和免疫调节活性。

实验结果

1. cb - P (HEMA - miR - 122) 的合成与表征：cb - P (HEMA - miR - 122) 的合成包含三步：首先合成环状 P (HEMA)（c - P (HEMA)₃₀）；接着将 c - P (HEMA)₃₀的悬垂羟基转化为叠氮功能基团，得到 c - P (HEMA - N₃)；最后通过点击反应将 DBCO 末端的 miR - 122 与 c - P (HEMA - N₃) 结合。通过质子核磁共振（¹H - NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR 光谱）和尺寸排阻色谱 - 多角度激光光散射（SEC - MALLS）等方法证实了 c - P (HEMA)₃₀的成功合成，¹H - NMR 和 FTIR 光谱也支持了 c - P (HEMA - N₃)₃₀的合成，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native - PAGE）则直观显示了 cb - P (HEMA - miR - 122) 的成功合成。
   优化点击偶联反应条件后发现，miR - 122 与聚合物摩尔投料比为 9:1、50°C 反应 48 h 时，cb - P (HEMA - miR - 122) 的产率最高（37.73%）且粒径最佳。动态光散射（DLS）显示自组装的 cb - P (HEMA - miR - 122) SNAs 平均流体动力学直径为 105.8 nm，多分散指数（PDI）为 0.12；透射电子显微镜（TEM）观察到其呈均匀球形，估计尺寸为 30 nm。该 SNAs 具有良好的胶体稳定性，包括短期储存、稀释和细胞培养基更换稳定性，在 10% 胎牛血清（FBS）中血清稳定性良好，对核酸酶降解有显著抗性。MTT 法和红细胞（RBC）溶血试验证实其生物安全性良好。
2. 体外细胞摄取和抗肿瘤效率：用 6 - 羧基荧光素（FAM）标记的 cb - P (HEMA - miR - 122 - FAM) SNAs 孵育 Hepa1 - 6 和 Bel - 7402 细胞，荧光倒置显微镜（FIM）观察和流式细胞术（FCM）分析表明，SNA 在 4 h 孵育内细胞摄取效率高，平均荧光强度比游离 miR - 122 高 4.0 倍。不同配方对肿瘤细胞增殖和迁移抑制能力研究发现，SNAs 对 Hepa1 - 6 和 Bel - 7402 细胞的抗增殖作用明显，孵育 48 h 后，细胞存活率分别为 59% 和 41%。FCM 分析细胞周期发现，SNA 处理的 Hepa1 - 6 细胞有 17% 停滞在 G2/M 期，是空白对照组的 1.5 倍。SNAs 对 Hepa1 - 6 细胞的抗迁移作用显著，细胞迁移率为对照组的 64.4%，侵袭实验显示 SNA 组细胞侵袭相对百分比为 82.3% 。体外实验证实 cb - P (HEMA - miR - 122 - FAM) SNAs 能有效进入细胞，递送 miR - 122 并发挥抑制肿瘤细胞增殖和迁移的治疗作用。
3. 体内肿瘤抑制分析：在 Hepa1 - 6 荷瘤 C57BL/6J 小鼠中通过尾静脉注射评估 cb - P (HEMA - miR - 122) SNAs 的体内抗肿瘤效率。注射 cb - P (HEMA - miR - 122 - FAM) SNAs 后，对肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行体外组织荧光成像发现，SNA 组 FAM 荧光强度在肿瘤部位呈时间依赖性积累，24 h 达到峰值，48 h 仍可检测到，因此确定后续体内抗肿瘤研究的给药频率为 48 h。治疗 15 天后，SNA 组能显著减小肿瘤大小，平均肿瘤抑制率（TIR）达 87.4%，远高于生理盐水和空白载体组，部分肿瘤完全消除，平均肿瘤重量仅 0.13 g。小鼠体重变化表明 SNAs 和空白聚合物载体体内生物安全性良好。苏木精 - 伊红（H&E）染色和血液指标测量显示，SNA 组肿瘤出现明显空洞和坏死，主要器官无异常，生化指标均在正常范围内。
4. 体内免疫激活：cb - P (HEMA - miR - 122) SNAs 优异的抗肿瘤效率归因于其免疫激活特性。免疫组织化学（IHC）观察发现，SNA 组肿瘤部位的 IFN 相关蛋白（p - STAT3）和迁移蛋白（波形蛋白 vimentin）表达下调。ELISA 检测血清免疫因子发现，SNA 组白细胞介素 IL - 6 和 IL - 10 含量显著低于对照组，肿瘤坏死因子 α（TNF - α）含量比对照组高 3.1 - 3.6 倍，IFN - γ 含量基本不变。FCM 分析肿瘤组织免疫细胞浸润发现，SNAs 诱导中性粒细胞从 2 型向 1 型高效极化，肿瘤组织中 N1/N2 比值达 77.0% ，显著高于对照组；肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）呈现 M2 - M1 极化趋势，M1/M2 比值为 79.5% ，巨噬细胞成熟比例也更高；SNA 组肿瘤部位 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞百分比均显著高于对照组。这些结果表明 cb - P (HEMA - miR - 122) SNAs 可通过 p - STAT3 途径增强免疫细胞因子释放，招募更多抗肿瘤免疫细胞浸润肿瘤部位，激活强大的免疫反应以消除肿瘤。

研究讨论

miR - 122 作为肝脏中丰富的非编码 RNA 分子，在肝癌的发生发展和治疗中起关键作用，但多数相关研究局限于体外细胞模型，高效的体内基因转移面临挑战，基于 miR - 122 的进一步药物开发和临床转化遇到瓶颈。本研究开发的 cb - P (HEMA - miR - 122) SNAs 为 miR - 122 的高效转染提供了新载体，验证了 miR - 122 的治疗潜力，并系统研究了其对肝癌的体内治疗效果。首次基于环状刷状拓扑结构的 SNA 用于肝癌基因治疗，通过单一基因治疗实现了高效的 N2 - N1 中性粒细胞极化，激活先天免疫，达到 87.4% 的高肿瘤抑制率，证实构建环状拓扑结构的 SNA 是增强肝癌基因免疫治疗的有效且简单的临床可转化策略。

不过，从实验室到临床的转化仍面临挑战，如 miR - 122 疗法的组织特异性和长期安全性等。本研究中基于环状聚合物的 SNA 在肝癌治疗中表现良好，但其对不同基因种类的适应性及临床转化潜力还需进一步研究。鉴于患者疾病特征和治疗反应的个体差异，优化药物经济学结果也面临挑战。精准医学依赖准确的诊断能力，需要基础研究的共同努力。本研究为将 cb - P (HEMA - miR - 122)₃₀纳米平台发展为诊断 - 治疗一体化系统奠定了基础，有望成为精准医学的创新纳米平台。