意外发现：一种抗核梭杆菌的新型杀菌共轭物 —— 改写抗菌研究格局

本文聚焦核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum），探索肽核酸（PNA）作为特异性反义抗生素的可行性。研究发现非靶向对照 CPP-PNA（FUS79）对多种梭杆菌菌株有杀菌活性，其机制可能与膜应激反应有关，为梭杆菌清除提供新思路。

　　

研究背景

人类口腔微生物组包含超过 700 种细菌，其中梭杆菌门的核梭杆菌备受关注。核梭杆菌是革兰氏阴性非运动厌氧细菌，在口腔和喉咙中存在。它能通过胃肠道或血行途径扩散到全身，在肿瘤部位富集，与肿瘤生长、转移、免疫反应抑制及化疗耐药相关 。抗生素治疗虽能抑制与核梭杆菌相关的肿瘤生长，但长期使用广谱抗生素会带来严重副作用，如全身炎症反应和疾病复发等。因此，开发针对核梭杆菌的特异性抗菌剂十分必要。

反义寡聚物（ASOs）有望成为可编程的物种特异性抗生素。其中，肽核酸（PNA）是常用的 ASO 形式，它是一种合成 DNA 类似物，由肽样骨架和天然核碱基组成，9 - 12 个核碱基的反义 PNA 对 DNA 和 RNA 有强结合亲和力，能有效抑制目标转录本翻译。然而，PNA 无法被动穿过细菌包膜，常与细胞穿透肽（CPPs）结合促进其进入细胞。已有研究表明，CPPs 能将 PNAs 递送至多种革兰氏阴性和阳性细菌，部分 CPP - PNA 共轭物对革兰氏阴性病原体有抗菌活性，但 PNA 对梭杆菌的生长抑制作用尚未得到验证。

研究过程

1. CPPs 进入核梭杆菌的研究：为探究 CPPs 作为 PNA 递送剂的潜力，研究人员将荧光团 TAMRA 与四种不同的 CPPs（(KFF)₃K、(RXR)₄XB、Seq471、Seq2373）偶联，以研究其进入核梭杆菌细胞质的效率。通过测定 CPP - TAMRA 共轭物的最低抑菌浓度（MIC），发现 Seq471 和 Seq2373 的 MIC 为 10 μM，(KFF)₃K 和 (RXR)₄XB 的 MIC 分别为 20 μM 和 > 40 μM 。为避免毒性，实验选择 5 μM 进行 CPP - TAMRA 摄取测试。
   利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察发现，(RXR)₄XB 具有很强且稳定的穿透效率，从 10 分钟起 TAMRA 阳性细胞率达 100%；(KFF)₃K 的摄取效率约为 15%，且随时间略有下降；Seq471 和 Seq2373 的转运极少甚至没有，TAMRA 阳性细胞率为 0% - 4% 。进一步通过 z - stack 记录证实 (RXR)₄XB 能将荧光团递送至细菌胞质而非细胞膜。此外，测定未偶联的 (KFF)₃K 和 (RXR)₄XB 的 MIC，分别为 > 40 μM 和 20 μM，后续实验选择 10 μM 作为初始浓度。
2. CPP - PNA 共轭物的设计：为抑制核梭杆菌生长，研究人员基于其他细菌物种的推断，选择了三个假定的必需基因：编码酰基载体蛋白的acpP（C4N14_04130）、编码对细胞分裂重要的 Z 环蛋白的ftsZ（C4N14_10675）和编码对 DNA 复制重要的促旋酶 A 亚基的gyrA（C4N14_02325） 。针对每个基因，设计 10 - mer PNAs 与翻译起始区域（TIR）互补，并对每个 PNA 序列进行随机化处理作为对照。
3. CPP - PNA 共轭物对核梭杆菌生长的影响：将处于对数中期的核梭杆菌 ATCC 23726（FNN23）培养物稀释至 1×10⁵ CFU/mL，与 10 μM 的 (KFF)₃K 或 (RXR)₄XB 共轭的 PNAs 共同孵育，通过 OD₆₀₀测量监测生长情况。结果显示，所有 CPP - PNA 均未观察到生长抑制现象，尽管部分 PNAs 导致生长延迟，但相应的随机化对照也有类似效果，表明该效应并非由靶向特异性翻译抑制引起。
   研究人员进一步探索了基于 (KFF)₃K - PNAs 的其他变体，包括不同长度的 PNAs（11mer 和 15mer）、不同的gyrA结合位点（gyrA_2）以及包含 D - 异构形式赖氨酸的 (KFF)₃K 肽，以避免蛋白水解切割 。在这些变体中，只有 11 - mer gyrA - 2 PNA 导致了约 40 小时的显著生长延迟，但高浓度并未进一步抑制生长，CFU 斑点试验也表明其抑制作用可能由非特异性效应引起。研究人员还选择了八个额外的靶基因，设计了 (KFF)₃K 共轭的 10 - mer 和 11 - mer PNAs，结果均未抑制梭杆菌生长。
4. FUS79 的发现：由于 (RXR)₄XB 在初始 TAMRA 筛选中显示出比 (KFF)₃K 更好的摄取效率，研究人员测试了 (RXR)₄XB 共轭的针对替代序列的 PNAs，包括针对acpP、ftsZ、gyrA的 TIR 周围序列以及针对梭杆菌丰富外膜蛋白的fomA的 11 - mer PNA 。作为对照，包含了非靶向的 10 - mer 和 11 - mer (RXR)₄XB - PNAs。结果发现，所有靶向 PNAs 均未损害生长，然而，非靶向的 11 - mer (RXR)₄XB - PNA（(RXR)₄XB - GACATAATTGT，命名为 FUS79）完全抑制了 FNN23 的生长。
5. FUS79 的抗菌特性研究：通过生长抑制试验测定 FUS79 的 MIC，结果显示其对 FNN23 的 MIC 为 10 μM，而随机化的 FUS79 序列（PNAscr）对生长无影响 。CFU 斑点试验表明，FUS79 从 24 小时起降低 CFU 计数，96 小时后琼脂平板上无可见 CFUs，证明 FUS79 在 10 μM 时对 FNN23 具有杀菌作用。
   研究人员测试 FUS79 对其他梭杆菌菌株的作用，包括 F. nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586（FNN25）、F. nucleatum subsp. animalis 7_1（FNA）、F. nucleatum subsp. vincentii ATCC 49256（FNV）、F. nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953（FNP）和 F. periodonticum 2_1_31（FPE） 。结果发现，FUS79 抑制了除 FNV 外的所有菌株的生长，表明其杀菌作用不限于 FNN23，但存在菌株特异性。
   测试 FUS79 对其他革兰氏阴性细菌的影响，包括牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）、大肠杆菌 K12（E. coli K12）、大肠杆菌 Nissle 1917（E. coli Nissle 1917）和鼠伤寒沙门氏菌（S. enterica） 。结果显示，FUS79 对这些细菌无生长抑制作用，表明其可能特异性抑制某些梭杆菌菌株。
6. FUS79 作用机制探究：FUS79 的核碱基序列在 FNN23 或 FNN25 的任何 TIR 中均无预测的完全反义匹配，在 FNA、FNP 和 FPE 的基因组中也无全长互补序列 。虽发现 19 个潜在的 FUS79 TIR 脱靶位点，但测试针对其中一个脱靶位点（trpB）的完全互补 PNA 序列，并未抑制 FNN23 生长，表明 FUS79 的杀菌作用不太可能通过反义脱靶机制。
   研究人员测试了 FUS79 的不同变体，包括不含 (RXR)₄XB 模块的 PNA79、缩短 (RXR)₄XB 模块的 (RXR)₃XB、与 (KFF)₃K 偶联的 FUS79 以及两个 FUS79 序列变体 。结果发现，只有原始的 FUS79 和序列变体 1（与全长 (RXR)₄XB 偶联）在 10 μM 时抑制 FNN23 生长，表明完整的 (RXR)₄XB 和 FUS79 序列的特定部分（GACATAWTWGT）对杀菌作用至关重要。
   不同实验条件下，如更高的细菌接种密度和替代细菌培养基，FUS79 的杀菌效果不同 。在 10⁷ CFU/mL 的 MHB 中，10 μM 的 FUS79 不再具有杀菌作用；在富含肽的培养基如脑心浸液（BHI）或哥伦比亚肉汤（ColB）中，FUS79 无作用。将 PNA 部分替换为磷酰胺吗啉代寡聚物（PMO），保留 FUS79 核碱基序列，发现 (RXR)₄XB - PMO79 在 10 μM 时与 FUS79 表现出相似的生长抑制作用，表明杀菌作用源于 ASO 核碱基序列和 (RXR)₄XB 的组合。
7. RNA - seq 分析：为研究 FUS79 的作用机制，对敏感菌株 FNN23 和抗性菌株 FNV 进行 RNA - seq 分析 。分别用 FUS79、PNAscr 或水处理两种菌株，在 30 分钟（监测早期转录组变化）和 16 小时（杀菌活性开始后）采集 RNA - seq 数据。
   主成分分析（PCA）显示，30 分钟时，两种菌株的样本间差异不大；16 小时后，FNN23 中水处理、FUS79 处理和 PNAscr 处理的样本形成三个不同的簇，而 FNV 中 FUS79 处理和 PNAscr 处理的样本与部分水处理样本聚为一簇 。这表明 16 小时的 FUS79 处理在敏感菌株 FNN23 中引发了与 PNAscr 不同的反应，而在抗性菌株 FNV 中没有。
   比较 FUS79 和 PNAscr 处理样本与水处理样本的转录组变化，发现 FUS79 和 PNAscr 在 16 小时均诱导 FNN23 中参与嘌呤代谢的转录本下调 。在 FNV 中，30 分钟时 PNAscr 处理仅上调参与血红素生物合成的hemC；16 小时时，两种 CPP - PNAs 均下调参与糖异生和辅因子生物合成的pckA和pdxS等。总体而言，梭杆菌对 CPP - PNA 处理似乎没有共同的转录组反应。
   进一步聚焦 FUS79 和 PNAscr 的差异，发现 16 小时时，FNN23 中 FUS79 处理与 PNAscr 处理相比，有 82 个差异表达转录本，其中 6 个属于 σ^E regulon 的转录本上调 。σ^E regulon 在革兰氏阴性细菌的全局应激反应中起重要作用，参与维持包膜完整性。在 FNN23 中，FUS79 处理 30 分钟时，σ^E（rpoE）基因表达上调，表明诱导了 σ^E应激反应。此外，FUS79 处理还导致一些 sRNA 和 mRNA 下调，如 4.5S RNA 等。抗性菌株 FNV 在 FUS79 处理后，与 PNAscr 相比，无显著上调的转录本，部分 sRNA 和 4.5S RNA 下调。
   对差异表达分析进行功能通路富集分析，发现 FUS79 处理后，敏感菌株 FNN23 中与核糖体、精氨酸和脯氨酸代谢、细菌分泌系统、肽聚糖合成、RNA 降解和萜类骨架合成等相关的 KEGG 通路显著诱导，这些通路与一般应激反应、抗生素处理反应或膜稳态相关 。同时，σ^E regulon 也显著上调。抗性菌株 FNV 中，只有 DNA 复制通路显著下调。

研究讨论

1. 外源性递送的 ASOs 在核梭杆菌中无序列依赖性反义活性：尽管有多种因素表明 PNAs 可能在梭杆菌中有效发挥作用，如核梭杆菌存在大量调节性 sRNAs，(RXR)₄XB 能有效穿透 FNN23 膜，且筛选的基因在其他细菌中对 PNA 介导的抑制敏感 。但研究中设计的 CPP - ASOs 未能抑制核梭杆菌生长。
   可能原因包括：CPP - PNA 共轭物向细菌细胞质的递送效率可能不足，虽然 (RXR)₄XB 能递送 TAMRA，但可能无法有效递送更大的 PNAs；对核梭杆菌基因 essentiality 的了解有限，尽管部分基因在其他细菌中是必需的，但在核梭杆菌中可能并非如此，且目前缺乏对核梭杆菌基因 essentiality 的完整认知；PNA 设计可能不够高效，核梭杆菌富含 AT 的基因组使设计高熔解温度和低自互补性的 PNAs 困难，且 mRNA 靶标的结合位点也会影响 ASO 的翻译抑制能力 。此外，核梭杆菌生长缓慢且挑剔，难以建立可靠的生长试验来区分 ASO 触发的生长抑制和正常生长波动。因此，需要进一步研究替代的 ASO 递送载体，如金纳米颗粒、维生素 B12、DNA - 四面体或铁载体等。
2. FUS79 的杀菌作用：FUS79 对多种梭杆菌菌株具有杀菌作用，但不太可能通过反义脱靶机制抑制敏感菌株生长 。FUS79 在 FNN23 的 TIR 中无完全互补序列，潜在的脱靶位点在 RNA - seq 实验中未显著失调，且针对潜在脱靶位点trpB的实验也未显示 mRNA 下调。此外，FUS79 序列变体 1 与 FUS79 具有相同的抗菌效果，但序列变化应阻碍其与互补序列的结合。
   RNA - seq 分析显示，FUS79 处理的 FNN23 中与膜稳态相关的转录本上调，因此 FUS79 的杀菌作用可能由特定的 CPP 和 ASO 序列组合触发的膜损伤介导 。FNV 的抗性可能与脂多糖（LPS）修饰影响 CPP 进入有关，FNV 的 LPS O - 抗原与敏感的 FNN25 不同，但其摄取 (RXR)₄XB - TAMRA 的速率与敏感的 FNN23 相似。
3. FUS79 对梭杆菌 σ^E反应的诱导作用：FUS79 在敏感的 FNN23 菌株中诱导了许多参与膜生物合成和稳态的转录本，KEGG 通路分析进一步证实 σ^E regulon 强烈诱导 。虽然不能确定 σ^E的激活与膜应激特异性相关，但 FUS79 处理 30 分钟后rpoE的上调表明诱导了 σ^E应激反应。
   研究推测，(RXR)₄XB 和 PNA79 序列的独特组合可能与细菌包膜相互作用，导致 σ^E regulon 激活和膜应激反应，最终抑制生长 。FUS79 的 MIC 取决于培养基类型和接种量，且 (KFF)₃K 共轭的 PNA79/PMO79 不影响细菌生长，支持了细胞毒性取决于 (RXR)₄XB 和特定序列元件的假设。进一步研究可测试具有相似摄取效率和进入模式的 CPP 与 PNA79 偶联时是否具有杀菌活性，以确定 (RXR)₄XB 对 FUS79 毒性的特异性作用。
4. 研究展望：广谱抗生素虽能从肿瘤部位清除核梭杆菌，但会破坏患者的保护性微生物群 。物种特异性 ASOs 可能是解决这一问题的方案，但目前研究尚未实现反义介导的核梭杆菌生长抑制。需要进一步研究确定 CPP - PNAs 是否有效到达核梭杆菌细胞质并结合其 mRNA 靶标，如通过质谱分析细胞组分来测试 CPP - PNA 的定位，但初步实验未成功。
   除了 ASOs，还有其他治疗方法可用于清除核梭杆菌，如物种特异性裂解噬菌体（如 FNU1）、窄谱抗生素、物种特异性抗菌肽、通过化学修饰的转移 RNA 片段靶向细菌、定制的 CRISPR 抗菌剂或靶向梭杆菌蛋白的单克隆抗体等 。FUS79 可作为开发选择性抑制剂的先导化合物，但需要确定其分子机制以实现临床应用。可通过膜模型系统、膜染料或分子动力学模拟等方法研究 FUS