探秘新冠病毒变异株 BA.2.86 及其后代的演化 “密码”：复制与免疫逃逸的深度解析

本文聚焦新冠病毒（SARS-CoV-2）BA.2.86 及其后代（JN.1、KP.2、KP.3）。通过构建重组病毒，对比其在人原代气道上皮细胞中的复制适应性和对人血清中和的敏感性，揭示关键突变影响病毒演化的机制，为防控新变异株提供重要依据。

　　

研究背景

新冠病毒（SARS-CoV-2）自 2019 年 12 月爆发以来，引发了全球大流行，造成了巨大的发病率和死亡率。其不断进化，出现了多种变异株，如 Alpha、Beta、Delta 和 Omicron 等。Omicron 又分化出众多亚谱系，其中 BA.2.86 及其后代（JN.1、KP.2、KP.3）逐渐成为优势毒株。BA.2.86 相较于 BA.2 和 XBB.1.5，其刺突蛋白有 30 多个氨基酸变化，自 2023 年 7 月被检测到后，在全球范围内传播，取代了之前的优势毒株。JN.1 由 BA.2.86 通过受体结合结构域（RBD）的 L455S 突变快速出现，增强了免疫逃逸和传播能力。随后，KP.2 和 KP.3 也相继出现，KP.2 带有额外的 R346T 和 F456L 突变，KP.3 则有 Q493E 突变 。虽然流行病学研究表明这些变异株传播能力增强与免疫逃逸和传播性提高有关，但在传染性 SARS-CoV-2 背景下，病毒适应性和免疫逃逸在 BA.2.86→JN.1→KP.2→KP.3 流行病学转变中的作用尚未充分研究。

材料和方法

1. 细胞：使用 Vero E6 和表达 TMPRSS2 的 Vero E6 细胞，在含特定成分的培养基中培养，且细胞支原体检测为阴性。
2. 人血清：收集两组人血清，一组为 61 份 XBB.1.5 感染（经逆转录 PCR [RT-PCR] 确定）15 - 117 天后（中位时间 45 天）的血清，来自 15 - 85 岁（中位年龄 46 岁）接种 2 - 4 剂 mRNA 疫苗的个体；另一组为 41 份 JN.1 感染（经 RT-PCR 确定）20 - 111 天后（中位时间 45 天）的血清，来自 7 - 84 岁（中位年龄 46 岁）个体，该组疫苗和感染史未确定。血清在中和试验前 56°C 热灭活 30 分钟。
3. 重组 mNeonGreen（mNG）SARS-CoV-2 BA.2.86 刺突变异株的构建：将 BA.2.86、JN.1、KP.2 和 KP.3 的完整刺突基因工程化到 mNG USA-WA1/2020 的感染性 cDNA 克隆中。通过体外连接组装全长感染性 cDNA 克隆，体外转录合成全长病毒 RNA，将 RNA 转录本电穿孔到 Vero E6-TMPRSS2 细胞中拯救重组病毒，收获上清并传代，所有重组病毒经测序确保基因组无意外突变。
4. 荧光聚焦减少中和试验（FFRNT）：采用既定的 FFRNT 方案，用 Vero E6 细胞、稀释的血清与 mNG SARS-CoV-2 孵育，感染细胞后，通过成像和计数荧光聚焦单位（FFUs）计算中和滴度，FFRNT₅₀定义为抑制 > 50% 荧光聚焦的最低血清稀释度。
5. 成对竞争实验：使用 MatTek Life Sciences 的原代 3D 黏液纤毛组织模型（HAE 细胞培养物）。将两种 mNG SARS-CoV-2 刺突变异株按 1:1 比例混合感染 HAE 细胞，感染后不同时间收集细胞上清和细胞内 RNA，通过特定引物对扩增含独特突变的 cDNA 片段，凝胶纯化后进行 Illumina NGS 分析。
6. 病毒粒子纯化和蛋白质免疫印迹（Western blot）：用聚乙二醇 - 8000 沉淀病毒粒子，洗涤后重悬于样品缓冲液，加热灭活后进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，用特异性抗体检测病毒刺突和核衣壳蛋白，并用 ImageJ 进行密度分析。
7. 空斑试验：将 Vero E6-TMPRSS2 细胞接种于六孔板，用稀释的病毒样品感染，加入覆盖培养基培养，染色后计数空斑并计算滴度。
8. 统计和可重复性：血清样本基于可用性收集，实验未随机化，患者信息在研究中被盲法处理。中和实验重复进行，竞争实验每组进行 5 次独立感染。使用特定统计方法分析数据，P < 0.05 认为具有统计学意义。

结果

1. SARS-CoV-2 mNG 刺突变异株的生成和表征：构建了含 BA.2.86 及其后代刺突基因的 mNG SARS-CoV-2 变异株，这些变异株在病毒拯救过程中表现出高感染性和强大的复制能力，感染滴度均超过 10⁷ PFU/mL 。其产生的空斑比原始 WA1 - 刺突 mNG SARS-CoV-2 小。通过 Western blot 分析发现，不同变异株的刺突蛋白（S）和核衣壳蛋白（N）存在差异，S1 和 S 的变异性大于 N，且不同变异株的刺突切割效率不同，BA.2.86 和 KP.3 约 70% - 80% 的刺突被切割，而 JN.1 和 KP.2 只有约 40% 的刺突被切割，表明 BA.2.86 及其后代的突变可能影响刺突加工。
2. JN.1 与 BA.2.86 相比，在 HAE 中复制减少但免疫逃逸增强：JN.1 比 BA.2.86 多了 L455S 突变，通过成对竞争实验发现，BA.2.86 在 HAE 中能有效竞争过 JN.1，说明 L455S 突变降低了 JN.1 在人呼吸道培养物中的适应性。FFRNT 试验显示，XBB.1.5 感染血清对 JN.1 - 刺突 mNG SARS-CoV-2 的中和 GMT 为 144，对 BA.2.86 - 刺突 mNG SARS-CoV-2 的中和 GMT 为 361，JN.1 对已有体液免疫的抗性更强，即 L455S 突变使 JN.1 免疫逃逸增强，但病毒复制适应性降低。
3. KP.2 与 JN.1 相比，在 HAE 中复制更好且免疫逃逸更强：KP.2 与 JN.1 相比，RBD 有 R346T 和 F456L 两个关键突变。竞争实验表明，KP.2 在 HAE 中复制更有效，能竞争过 JN.1。对 41 份 JN.1 感染血清的中和试验显示，该血清对 JN.1 - 刺突 mNG SARS-CoV-2 的中和 GMT 为 437，对 KP.2 - 刺突 mNG SARS-CoV-2 的中和 GMT 为 174，说明 KP.2 对出现前的体液免疫逃逸能力更强，且 JN.1 感染或 JN.1 刺突适应疫苗可增强对 JN.1 的体液免疫。
4. KP.3 与 KP.2 相比，在 HAE 中复制增强且对 JN.1 感染血清的中和抗性相似：KP.3 刺突与 KP.2 刺突的区别在于 RBD 缺少 R346T 突变但有 Q493E 突变。竞争实验中，虽然初始时 KP.3 刺突在 Vero E6-TMPRSS2 细胞中的感染性低于 KP.2 刺突，但在 HAE 中，KP.3 在感染 3 天后复制适应性优于 KP.2。对 JN.1 感染血清的中和试验显示，该血清对 KP.3 - 刺突 mNG SARS-CoV-2 的中和 GMT 为 193，与对 KP.2 - 刺突 mNG SARS-CoV-2 的中和 GMT 无显著差异，表明 KP.3 在保持对 JN.1 感染血清中和抗性的同时，复制适应性增强。

讨论

1. 突变对病毒演化的影响机制：本研究揭示了 BA.2.86 后代中反复出现的刺突突变驱动病毒从 BA.2.86 到 JN.1，再到 KP.2，最后到 KP.3 演化的不同机制。L455S 突变赋予 JN.1 增强的免疫逃逸能力，导致从 BA.2.86 到 JN.1 的快速演化；JN.1 到 KP.2 的转变是由于 R346T 和 F456L 突变使复制适应性和免疫逃逸能力均提高；KP.3 中的 F456L 和 Q493E 突变进一步增强了复制适应性，推动了从 KP.2 到 KP.3 的转变。
2. 免疫逃逸与复制适应性的关系：BA.2.86 后代积累的 L455S 和 F456L 等突变使其对单克隆抗体和体液免疫具有很强的抗性。研究发现，病毒刺突变异株在人呼吸道上皮细胞中的适应性与刺突 - ACE2 结合亲和力呈正相关。例如，L455S 突变虽增强了 JN.1 的免疫逃逸，但降低了其 ACE2 结合亲和力，导致复制速度减慢；而 KP.2 的 R346T 突变及 L455S 和 F456L 的协同作用，提高了 ACE2 结合亲和力，使其复制能力增强；KP.3 的 Q493E 和 F456L 组合显著增加了 ACE2 结合亲和力，进一步提升了复制适应性。
3. 突变对刺突切割的影响：BA.2.86 后代 RBD 中的突变会影响病毒粒子内刺突的切割。JN.1 和 KP.2 病毒粒子的 S1/(S1 + S) 比值明显低于 BA.2.86 或 WA1，可能是由于 L455S 突变；而 KP.3 病毒粒子的 S1/(S1 + S) 比值与 BA.2.86 和 WA1 相似，表明 KP.3 中的 Q493E 突变补偿了 L455S 导致的刺突加工效率降低。虽然具体机制尚待进一步研究，但这些 RBD 突变可能通过影响刺突加工，进而影响病毒感染性。
4. 与其他研究的差异及本研究优势：与假病毒系统的研究结果相比，本研究结果与流行病学数据更一致。假病毒系统中，BA.2.86、JN.1、KP.2 和 KP.3 的感染性存在不一致的报道。本研究使用活减毒 mNG SARS-CoV-2，在原代人呼吸道上皮细胞培养物中进行成对竞争实验，更能反映真实的 SARS-CoV-2 感染情况，具有更高的准确性和可重复性。
5. 研究的局限性和未来方向：本研究存在一定局限性，仅关注了刺突突变对免疫逃逸和病毒复制适应性的影响，未探讨非刺突或同义突变的作用。例如，野生型 KP.2 与 JN.1 在非结构蛋白 3（NSP3）上存在 T1465I 突变，其对 KP.2 优势的贡献有待进一步研究。此外，研究未涉及非中和抗体和 T 细胞免疫的作用，且对感染史、疫苗接种等信息了解有限。未来需要继续监测新出现的 SARS-CoV-2 变异株的免疫逃逸和复制适应性，为疫苗和单克隆抗体设计提供依据，以应对新的免疫逃逸变异株。