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在 RNA 疫苗研究领域，自扩增 RNA（saRNA）疫苗虽潜力巨大，但存在反应原性问题。研究人员针对此，开展调控核质运输以控制 saRNA 疫苗反应原性的研究。结果显示，RNAx 可降低反应原性并维持或增强免疫原性。这为改进 saRNA 疫苗提供了新途径。
在疫苗研发的赛道上，RNA 脂质纳米颗粒（LNP）疫苗曾掀起一阵热潮，它就像疫苗界的 “闪电侠”，能快速响应新兴病原体，还具备强大的保护力和简化的生产流程。然而，它也并非完美无缺。就拿新冠 mRNA - LNP 疫苗来说，虽然在公共卫生领域大显身手，可在达到保护剂量时，却会引发一些令人头疼的副作用，而且大规模快速生产的成本也很高。自扩增 RNA（saRNA）疫苗此时崭露头角，它只需较低剂量就能提供更持久的保护，堪称疫苗界的 “潜力股”。但 saRNA 疫苗也有自己的 “小脾气”，它在细胞内自我复制产生的双链 RNA（dsRNA）中间体会激活机体的天然免疫信号通路，虽然这能带来一定的佐剂效应，可一旦过度激活，就会引发强烈的反应原性，还可能抑制疫苗的免疫反应，比如干扰抗原表达。这就像一把双刃剑，让科研人员陷入了两难的境地。为了驯服这把 “双刃剑”，来自美国 ExcepGen Inc. 的研究人员挺身而出，开展了一项意义重大的研究。他们把目光聚焦在调节核质运输（NCT）上，试图通过这一关键环节来控制 saRNA 疫苗的反应原性，同时又不影响其免疫原性。最终，他们发现了一种名为 RNAx 的 mRNA，它就像疫苗的 “智能管家”，能精准调控免疫反应，这项研究成果发表在了《npj Vaccines》上。
研究人员主要运用了细胞实验、动物实验以及多种检测技术来开展研究。细胞实验使用了 BJ 成纤维细胞和 293 T 细胞等；动物实验选用了 C57BL/6 小鼠和 BALB/c 小鼠；检测技术包括体外转录（IVT）、脂质纳米颗粒（LNP）制备、体外转染、细胞因子检测、流式细胞术、体内成像、疫苗接种研究、酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）、血凝抑制试验（HAI assay）等，实验样本主要来源于细胞系和实验动物。
RNAx 增强 saRNA 的目的基因（GOI）表达
研究人员将 RNAx 与 saRNA 以两种形式组合：“顺式（in cis）”，即作为单个 RNA 分子在内部核糖体进入位点（IRES）控制下；“反式（in trans）”，即作为离散的 mRNA。在体外实验中，利用委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）Simplicon 载体构建报告基因，转染 BJ 细胞后发现，与仅使用 saRNA 相比，顺式组合时 RNAx 可使流感血凝素（HA） - 纳米荧光素酶（nLuc）表达提高 62 倍，分泌型 nLuc（sec - nLuc）提高 34 倍，萤火虫荧光素酶（fLuc）提高 8 倍；反式组合时，sec - nLuc 表达可提高 11 倍，且呈剂量依赖性。在体内实验中，给 C57BL/6 小鼠注射含 HA - nLuc 的 saRNA - LNP，反式 RNAx 在注射后 1 天使 nLuc 表达显著提高 170 倍，计算曲线下面积（AUC）发现，反式 RNAx 也能显著增强 GOI 表达，且 nLuc 表达峰值出现时间早于仅使用 saRNA 组。此外，RNAx 还能增强未修饰 mRNA 的 GOI 表达，这表明 RNAx 可增强多种炎症性 RNA 的 GOI 表达。
RNAx 抑制原代人免疫细胞中的促炎细胞因子
Cardiovirus 的前导蛋白在自然病毒环境中可抑制天然信号通路和干扰素（IFN）产生。研究人员用含 HA - nLuc 的 saRNA - LNP 处理人外周血单个核细胞（PBMCs），发现 saRNA 单独处理可诱导 15 种细胞因子表达增加至少 2 倍，而加入 RNAx 后，14/15 种细胞因子被抑制。其中，反式 RNAx 对 IFN - α 的抑制效果尤为显著，同时还能使 nLuc 表达提高 2 - 6 倍，而顺式 RNAx 效果不明显。利用锌指结构域突变的 RNAx 进行实验，发现其无法抑制 IFN - β 产生，进一步验证了 RNAx 抑制 IFN 产生的特异性。通过 TRRUST 工具分析，发现多种转录因子与 RNAx（反式）敏感的细胞因子相关，表明 RNAx 可抑制多种独立的信号通路。
RNAx 抑制 5mC 修饰的流感 HA saRNA - LNP 疫苗的血清反应原性生物标志物
研究人员设计了一种优化的流感 HA 疫苗构建体，将 5 - 甲基胞苷（5mC）修饰的核苷整合到 VEEV 的 TC - 83 菌株中，构建表达流感 HA 的疫苗。实验发现，反式 RNAx 可抑制 IFN - β 分泌和 tetherin 表达，且在多种细胞和体内实验中，反式 RNAx 对 GOI 表达的增强和促炎细胞因子的抑制作用更稳定、显著，因此后续研究主要聚焦于反式 RNAx。给 C57BL/6 小鼠接种 5mC 修饰的 HA saRNA - LNP 疫苗后，RNAx 在初次免疫和加强免疫后均能显著抑制 IFN - α、IL - 6、KC、MCP - 1 和 TNF - α 等细胞因子水平，在不同小鼠品系和疫苗载体实验中均得到类似结果，表明 RNAx 能有效抑制与疫苗不良反应相关的细胞因子。
RNAx 不改变细胞免疫反应的强度或 Th1/Th2 平衡
由于细胞免疫反应受天然信号诱导的影响，研究人员测试了 RNAx 对疫苗细胞免疫反应的影响。给 C57BL/6 小鼠接种不同剂量的 HA saRNA - LNP 疫苗并添加不同量的反式 RNAx，分离脾细胞刺激后检测发现，RNAx 的加入不改变 IFN - γ 和 IL - 4 分泌细胞的数量，表明 RNAx 可保留细胞免疫反应的整体平衡和 Th1 偏向性。
RNAx 增强 HA saRNA - LNP 疫苗单次注射后的抗体滴度
鉴于 IL - 6 对 RNA - LNP 疫苗抗体反应有重要影响，而 RNAx 可抑制 IL - 6 等细胞因子，研究人员检测了 RNAx 对抗体反应的作用。给 C57BL/6 小鼠接种不同剂量的 5mC 修饰的 TC - 83 HA saRNA - LNP 疫苗并添加不同比例的 RNAx，结果显示，在 0.05μg 剂量下，10% RNAx 可使结合抗体滴度显著提高 7 倍；在 BALB/c 小鼠模型中，1% RNAx 在 0.05μg 总剂量下也能提高结合抗体滴度，且 RNAx 在不同小鼠品系和 VEEV 载体实验中均未抑制抗体反应。
RNAx 在疫苗加强免疫后维持并偶尔增强抗体反应
在三项疫苗接种研究中，分析加强免疫 2 周后的结合抗体和病毒中和滴度发现，在 0.5μg 总剂量下，C57BL/6 小鼠接种 5mC 修饰的 TC - 83 构建体，1% RNAx 可使中和滴度提高 3 倍；BALB/c 小鼠在 0.05μg 剂量下，1% RNAx 可使抗 HA 抗体结合滴度显著提高 2 倍。虽然不同小鼠品系和 VEEV 载体中 RNAx 增强抗体反应的最佳剂量不同，但反式 RNAx 在高剂量下仍能维持抗体滴度，且顺式 RNAx 在所有测试条件下均未增强抗体反应。
综上所述，研究表明 RNAx 能有效抑制 saRNA - LNP 疫苗引发的过度天然信号，降低反应原性，同时维持甚至增强免疫原性。这一成果为改进 saRNA 疫苗提供了新的方向，有望提高疫苗的耐受性和有效性，为未来疫苗研发开辟了新途径。不过，目前的研究主要基于动物实验和体外实验，还需要进一步开展更大规模的动物实验和人体临床试验，以全面评估 RNAx 在人体中的效果和安全性，让这一科研成果能真正造福人类健康。
