大肠杆菌全基因组水平低硫氰酸盐应激响应的特征解析：RclABC防御系统的协同作用机制

本研究通过RNA测序技术首次系统揭示了大肠杆菌对免疫氧化剂低硫氰酸（HOSCN）的特异性转录响应，发现其显著区别于H2O2、超氧化物等其他氧化应激模式。研究重点阐明了RclABC操纵子（含HOSCN还原酶RclA及功能未知的RclB/RclC）在防御体系中的协同作用，发现任一基因缺失均导致相似的全局转录重编程，提示三者构成完整防御模块。尤为关键的是，研究通过外膜蛋白（OMP）突变实验证实膜通透性改变影响HOSCN敏感性，但排除了RclB通过调控OmpC/F丰度或保护周质空间氧化的假说，为后续探索其分子机制提供了新方向。

　　

ABSTRACT
氧化应激是哺乳动物免疫系统调控微生物种群和清除病原体的重要手段。尽管细菌对过氧化氢（H₂O₂）和次氯酸（HOCl）等宿主源性氧化剂的逃逸机制已有较多研究，但对低硫氰酸盐/低硫氰酸（OSCN^–/HOSCN）等氧化剂的遗传响应仍知之甚少。本研究通过RNA测序揭示了大肠杆菌对HOSCN的全局转录响应特征，发现其显著区别于已知的其他氧化应激模式，且RclA、RclB或RclC任一缺失均导致类似的转录组扰动，表明三者构成协同防御系统。

INTRODUCTION
先天免疫系统通过多种机制调控上皮表面微生物群落，其中活性氧化剂的产生是关键手段之一。HOSCN作为乳过氧化物酶（LPO）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）和髓过氧化物酶（MPO）的催化产物，主要通过氧化巯基破坏细菌蛋白功能。近年研究发现大肠杆菌rcl操纵子编码的HOSCN还原酶RclA及其同源蛋白RclB/RclC参与防御，但后两者的作用机制尚未阐明。

RESULTS AND DISCUSSION
独特的HOSCN转录响应特征
600 μM HOSCN处理诱导大肠杆菌产生特异性响应：rclABC基因显著上调（rclA表达量最高），氰酸酯代谢基因cynTSX上调10-50倍，锌饥饿响应基因（zinT/znuC）激活，而冷休克基因（csp家族）显著下调。与H₂O₂或HOCl响应相比，HOSCN仅微弱激活OxyR和SoxRS系统，且不引发明显的蛋白热休克响应。

Rcl基因缺失的协同效应
ΔrclA/B/C或三敲除株对HOSCN敏感性增强，但转录响应高度相似：锌稳态基因表达增幅提高5-10倍，氧化应激标志物（grxA/nemR/soxR）上调更显著。值得注意的是，外膜孔蛋白基因ompC的诱导在ΔrclB/C中消失，而在ΔrclABC中恢复，提示RclB/RclC可能通过调控HOSCN膜通透性发挥作用。

外膜蛋白的防御作用
ΔompC/ΔompF双敲除株表现出显著HOSCN抗性，证实外膜通透性降低可增强防御。虽然RclB与OMP调控蛋白RcsF结构相似（RMSD=1.47?），但蛋白质组分析显示其缺失不影响OmpA/C/F丰度，周质氧化探针实验也排除了其保护周质空间的可能性。

DUF1471蛋白家族的功能线索
RclB属于DUF1471家族（含10个大肠杆菌成员），与铜抗性蛋白BhsA和OmpA降解调控因子YjfN同源。其中BhsA在ΔrclABC中特异性高表达，但异源表达反而增强HOSCN敏感性，暗示该家族成员可能通过复杂互作网络调控膜功能。

CONCLUSIONS
本研究首次绘制大肠杆菌HOSCN应激的全基因组转录图谱，揭示RclABC构成协同防御系统：RclA直接还原HOSCN，而RclB/RclC可能通过未知机制调控其细胞分布或活性。尽管排除了简单的OMP调控假说，但外膜蛋白突变体的表型仍提示膜通透性是防御关键环节，为后续探索DUF1471家族蛋白的功能机制奠定基础。