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泰乐菌素（TYL）污染备受关注。本文分离出Kurthia gibsonii TYL-A1 菌株，其能高效降解 TYL。研究剖析了降解性能、产物、毒性、基因组等，揭示了降解机制，凸显该菌株在环境修复中的潜力，为治理抗生素污染提供新思路。
泰乐菌素污染现状与研究背景
抗生素在水产养殖和医学领域广泛应用，用于抗菌和促进生长。中国是全球最大的兽用抗生素消费国，2017 年全球兽用抗生素使用量达 9309 吨，预计到 2030 年将增至 104079 吨。泰乐菌素（TYL）作为一种大环内酯类兽用抗生素，常被用于治疗畜禽支原体疾病。但由于抗生素的滥用和其结构稳定性，大量未灭活的抗生素随粪便排出，造成环境污染。在墨西哥猪场，每千克猪通过废水向环境中释放约 284.3μg 的 TYL ，在肉鸡、奶牛和猪的粪便中也能检测到 TYL。抗生素可通过食物等途径进入人体，在体内积累会引发器官过敏、免疫抑制等病理变化，还会影响生物系统和微生物群落，加速耐药病原体和耐药基因的形成。
目前，去除环境中抗生素的技术多样，包括吸附法、高级氧化法（如光催化氧化、臭氧氧化、过硫酸盐氧化等）、电化学方法、Fenton 氧化法以及生物修复方法（如植物修复和微生物降解）。其中，微生物降解因具有安全、有效、操作简便、特异性强且不易产生二次污染等优点，成为研究热点。然而，已知具有 TYL 降解能力的微生物较少，其降解机制也鲜见报道。本研究旨在筛选具有 TYL 降解功能的菌株，评估其降解性能和产物，对菌株进行全基因组测序，分析相关基因，为 TYL 降解提供生物资源和理论依据，并探索其在实际废水处理中的应用。
材料与方法
实验所用 TYL 购自上海源叶生物技术有限公司，甲醇和乙腈分别购自 Fisher Scientific Co，其他化学试剂均为分析纯。实验使用的培养基有矿物盐培养基（MSM）和 Luria-Bertani（LB）培养基。采用高效液相色谱法（HPLC）测定 TYL 残留，参照 Zhao 等人的色谱条件。
实验菌株 TYL-A1 从土壤中分离得到，经鉴定为Kurthia gibsonii TYL-A1。将其接种到新鲜胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中复苏，经离心、洗涤后调整菌液浓度用于后续实验。通过单因素实验，研究不同氮源、初始 TYL 浓度、培养温度、初始 pH、细菌接种量和金属离子对 TYL 降解的影响。
基于单因素优化实验结果确定最佳培养条件，绘制降解动力学曲线，拟合 ln (Ct/C0) 与时间（t，h）的关系，分析降解动力学。根据公式计算降解速率常数（k）和半衰期（t1/2）。
利用 Biolog 生态板评估 TYL-A1 对不同碳源的利用模式，在板中添加 TYL 使其终浓度为 0 或 75mg/L，在 30°C 避光培养，连续 10 天用酶标仪在 590nm 处监测颜色变化，计算平均孔颜色发展（AWCD），判断碳源利用程度。
将 TYL-A1 菌悬液在无机盐培养基中培养后离心，分别获取上清液（含胞外酶）和菌体沉淀（破碎后获取胞内酶）。将胞内、胞外酶制剂分别加入含 75mg/L TYL 的 PBS 中，在最佳条件下反应，用 HPLC 测定 TYL 残留浓度，判断酶的降解作用。
将 TYL-A1 菌悬液接种到含 75mg/L TYL 的培养基中培养，分别在 12 小时和 4 天取样。经萃取、复溶后，采用液相色谱 - 质谱联用仪（LC-MS）分析降解产物，质谱采用电喷雾电离正离子模式，参考 Li 等人的色谱条件。
以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为测试菌株，设置阳性对照组（PC，不含 TYL 的 MSM）、阴性对照组（NC，含 75mg/L TYL 的 MSM）和生物降解产物组（TC，含 TYL-A1 降解 TYL 5 天后的上清液）。向各组加入等量菌悬液，在 37°C 培养，设置 3 个重复，通过测定 600nm 处吸光度评估细菌生长情况，分析降解产物毒性。
将 TYL-A1 接种到 TSB 培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体，经洗涤后提取基因组 DNA。利用 Nanopore PromethION 平台和 Illumina NovaSeq PE150 进行全基因组测序，使用 Unicycler 软件进行基因组组装，GeneMarkS 软件预测基因，通过 Nr、SwissProt、COG、KEGG 和 GO 等数据库进行注释，用 Circos 软件绘制基因组图谱。
采集新鲜未发酵的牛粪废水，经固液分离、静置、过滤、稀释、灭菌后，分为实验组（添加 TYL-A1 菌悬液）和对照组（不添加菌株但含金属离子），每组设置 3 个重复，研究 TYL-A1 对废水中 TYL、化学需氧量（COD）、氮（N）和磷（P）含量的影响。
结果与讨论
不同氮源对 TYL 降解影响显著，酵母浸出粉作氮源时降解率最高，达 74.74%，因此将 MSM 中的氮源替换为酵母浸出粉。随着初始 TYL 浓度升高，降解率下降。TYL-A1 能完全降解 50mg/L 的 TYL，75mg/L 时降解率为 72.78% ，但 100mg/L 和 125mg/L 时仅为 19.57% 和 10.31% ，高浓度 TYL 可能抑制菌株生长。
温度和 pH 对 TYL 降解影响明显。30°C 时降解效率最高，达 74.09% ，温度过高或过低都会降低降解效率。pH 7 时 TYL-A1 降解效率达 70% ，在 pH 5 - 9 范围内菌株能保持有效降解能力，过酸或过碱环境虽会促进 TYL 自然降解，但不利于菌株生长和代谢。接种量在 1% - 3% 时，降解率随接种量增加而升高，3% 接种量时降解率达 99.71% ，超过 3% 后降解率无显著变化，考虑成本，选择 3% 接种量进行后续实验。在最佳条件（30°C，pH 7.0，3% 接种量）下，5 天后 TYL 降解率达 99.68%。与之前报道的菌株相比，TYL-A1 降解性能更优。通过一级动力学方程拟合，TYL-A1 降解 TYL 的回归系数（R2）为 0.9417，半衰期为 0.8862 天（约 21 小时），远低于之前报道的 TYL 在粪便中的半衰期（4 - 8 天），表明 TYL-A1 能显著加速 TYL 降解。
研究金属离子对 TYL-A1 降解 TYL 的影响发现，Fe2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+和 Fe3+等金属离子对降解无显著影响（P>0.01）。其中，Ca2+在 2 - 3 天内显著加速降解（P<0.01），2 天内降解率达 94.5% ，可能是因为 Ca2+通过共代谢促进降解，维持细菌渗透压和酶活性。Zn2+对降解有抑制作用，但不显著。这表明 TYL-A1 能适应金属和抗生素共污染环境，未来可研究其对金属离子的降解能力。
添加 TYL 会影响 TYL-A1 的 AWCD 值，表明其碳源利用和代谢活性降低。在含 TYL 条件下，TYL-A1 对羧酸类碳源利用能力最强，其次是糖类，对聚合物和酚酸类利用较少。丙氨酸甲酯和 D - 木糖分别是羧酸类和糖类中利用率最高的碳源，可考虑作为共底物增强 TYL 生物降解。
研究发现胞内酶降解 TYL 的效率高于胞外酶，降解率分别为 80.438% 和 46% 左右。参与 TYL 降解的主要酶可能是大环内酯失活酶、水解酶和氧化还原酶，且多为胞内酶，但具体酶种类和作用机制有待进一步研究。
通过 LC-MS 分析 TYL-A1 降解 TYL 的中间产物，鉴定出底物 TYL 及两种潜在代谢产物 T1 和 T2。推测其降解途径为：TYL-A1 先作用于霉素糖产生 T1，T1 再失去糖基、水解酯键、发生氧化反应，形成小分子物质 T2。该降解途径与之前报道有所不同，产物结构更小。
毒性分析表明，TYL-A1 降解产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制作用明显低于 TYL 本身，说明降解产物毒性显著降低，微生物降解在降低 TYL 环境毒性方面具有优势。
TYL-A1 基因组测序结果显示，其染色体为环状，序列长度 3028232bp，GC 含量 36.67% ，有 3027 个编码基因；质粒长度 52604bp，GC 含量 35.17% ，有 61 个编码基因。通过数据库注释分析，发现该菌株功能丰富，代谢和催化活性强。KEGG 分析表明，与萜烯、聚酮和糖代谢相关的基因可能参与 TYL 生物降解，24 个基因参与异源生物降解和代谢途径，说明 TYL-A1 还能降解其他有机污染物。CAZy 数据库分析显示，菌株含有多种与碳水化合物相关的基因，如糖苷水解酶（GHs）和糖基转移酶（GTs），可能在 TYL 降解中发挥重要作用。此外，TYL-A1 基因组中含有多种抗生素耐药基因（ARGs），对多种抗生素具有耐药性，对 TYL 的耐药归因于大环内酯耐药基因mtrA、efrB、vmlR、MexD、ErmB和mphB等，其中mphB通过编码 2′ - 磷酸转移酶使大环内酯类抗生素失活。
将 TYL-A1 应用于奶牛场废水处理实验，结果显示，废水中 TYL 降解率在 3 天内迅速上升至 47% ，8 天后达到 80% ，10 天后为 86.19% ，低于在 MSM 中的降解率，这可能是因为废水环境复杂，影响菌株生长和酶活性，且存在碳代谢物抑制作用。添加 TYL-A1 后，废水中 COD、总氮（TN）和总磷（TP）含量均有所降低，实验结果表明 TYL-A1 在水产养殖废水处理中具有潜在应用价值。
研究结论
本研究从 TYL 污染土壤中分离出高效降解菌株Kurthia gibsonii TYL-A1，该菌株对 TYL、温度、pH 和金属离子具有耐受性，能显著缩短 TYL 半衰期。胞内和胞外酶共同参与 TYL 降解过程，基于 LC-MS 分析提出了新的生物代谢途径。全基因组测序揭示了参与 TYL 降解的相关基因，为理解 TYL 降解机制提供了依据。本研究为 TYL 污染环境的生物修复提供了重要的微生物种质资源，有望为治理环境中的抗生素污染开辟新途径。
