mRNA 鸡尾酒疫苗：抗击非洲猪瘟（ASF）的新希望

本文聚焦非洲猪瘟（ASF），研发了含 6 种非洲猪瘟病毒（ASFV）抗原的 mRNA 鸡尾酒疫苗。经小鼠和猪实验，该疫苗能诱导强大的体液和细胞免疫反应，且安全性良好，为 ASF 疫苗开发带来新方向。

　　

一、引言

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种出血性传染病，对家猪具有极高的传染性和致死率。其临床症状包括高烧、厌食、喘息、口鼻分泌物增多、胃肠道反应以及全身发绀，怀孕母猪感染后还可能出现自然流产。ASF 在全球范围内传播，给养猪业造成了巨大的经济损失，如中国在 2019 年因 ASF 疫情，大量生猪死亡和被扑杀，经济损失约达 1112 亿美元，占当年国内生产总值的 0.78%。

ASFV 是一种大型 DNA 病毒，结构复杂，基因组约 170 - 190kb，编码超过 150 种蛋白质，其中 68 种为结构蛋白。病毒由包膜、衣壳、内膜、核心壳和内核组成，装配成直径超 260nm 的二十面体多层结构。由于其多种蛋白参与感染和免疫逃逸过程，且许多蛋白功能及与宿主细胞膜的相互作用尚不明确，使得 ASF 疫苗的研发极具挑战性。

目前，市面上有两种处于试验阶段的减毒活疫苗，即美国农业部与相关公司合作开发的 ASFV - G - ΔI177L，以及 Pirbright Institute 开发的 ASFV 基因型 II 修饰活疫苗（MLV）。虽然这两种疫苗在一定程度上能保护猪免受 ASFV 感染，但存在病毒 shedding、副作用和毒力返强等风险。因此，研发新的 ASF 疫苗迫在眉睫。

mRNA 疫苗因具有安全性高、诱导免疫反应能力强、成本效益高和研发周期短等优点，在传染病疫苗研发领域备受关注，已成功应用于多种病毒和细菌感染的预防，如新冠疫苗。然而，mRNA 疫苗技术尚未应用于 ASF 疫苗开发。本研究旨在设计一种针对 ASFV 关键抗原的 mRNA 鸡尾酒疫苗，评估其在小鼠和猪体内的免疫反应，为 ASF 疫苗的研发提供新的方向。

二、材料与方法

1. 细胞培养和动物模型：使用 HEK293T 细胞，培养于含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，在 37°C、5% CO₂培养箱中培养。选用 6 - 8 周龄的雌性 BALB/c 小鼠和 8 周龄的雌性猪作为实验动物，分别购自广东相关生物技术公司。阳性血清购自中国兽药监察所。
2. 肽和蛋白质：化学合成对应预测表位的肽，溶解于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 2mg/mL 的肽储备液，分装后于 - 20°C 保存备用。
3. 重组载体：设计合成 pVAX1 (+) 质粒载体用于 RNA 体外合成，在开放阅读框（ORF）上游引入组织型纤溶酶原激活剂（tPA）信号肽，增强 ASFV 串联蛋白的表达和分泌。5’非翻译区（UTR）和 3’UTR 序列分别采用特定序列，其中 3’UTR 序列源自 Moderna 公司的专利。
4. 靶蛋白的表达和纯化：将 6 种蛋白编码基因克隆到 pET28a 表达载体，转化至 BL21 (DE3) pLysS 感受态细胞。在异丙基 - β - D - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，表达带有 6×His 标签的重组蛋白。通过高压均质机破碎细胞，经 NTA - Ni 亲和层析和尺寸排阻层析纯化目标蛋白。
5. mRNA 合成：以 Pig/HLJ/2018 株的抗原序列为模板，经 T7 聚合酶介导的体外转录合成 mRNA。对 ORF 进行密码子优化，并添加侧翼 5’和 3’UTR 以及 poly - A 尾。使用 N1 - 甲基假尿苷（m1Ψ）三磷酸替代尿苷三磷酸（UTP）合成修饰核苷的 mRNA，5’端加 Cap1 帽，并用 Monarch RNA Cleanup Kit 纯化 mRNA，通过 Nanodrop 2000c 检测 mRNA 的浓度和纯度。
6. mRNA - LNP 的制备和质量控制：脂质纳米颗粒（LNPs）由可电离阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质按 50:10:38.5:1.5 的摩尔比混合而成。mRNA 溶解于柠檬酸盐缓冲液（pH = 4.0），与脂质按 1:3 的比例通过 T - mixer 混合，然后用预灭菌的 Amicon Ultra - 15 离心过滤器在 PBS（pH = 7.4）中透析去除乙醇，重复 3 次。最终的 mRNA 制剂经 0.22μm 滤膜灭菌后于 4°C 保存。对 mRNA - LNP 进行质量控制评估，包括包封效率、zeta 电位、平均粒径和粒径分布，分别使用 RiboGreen RNA Detection Kit、Malvern Zetasizer 和 Zetasizer Nano ZS 系统进行检测。
7. mRNA 转染 HEK293T 细胞：使用 Lipofectamine 2000 按照说明书将 mRNA 转染至 HEK293T 细胞。转染前更换为 Opti - MEM 培养基，将 2.5μg mRNA - Tandem 稀释于 250μL Opti - MEM 中，与 5μL Lipofectamine 2000 混合，室温孵育 15min 后加入细胞培养基中。收获细胞裂解液和上清液用于蛋白质分析。
8. 蛋白质免疫印迹（Western blot）：对转染 mRNA（B602L、CD2V、EP153R、P30、P54 和 P72）的细胞全细胞裂解液和上清液进行 Western blot 分析。将样品与 4× 上样缓冲液混合，在 4% - 20% SurePAGE 凝胶中分离，然后转移至聚偏二氟乙烯膜。用 5% 牛血清白蛋白（BSA）在含 0.1% Tween 的 1× PBS（PBST）缓冲液中封闭膜，用 1:2000 的抗 GM - CSF 抗体孵育 2h 检测 ASFV 串联蛋白，经 PBST 洗涤 3 次后，再用 1:2000 稀释的山羊抗兔 IgG - HRP 孵育 1h，最后使用 Tanon 5200 化学发光成像系统进行显影。
9. 小鼠实验：为评估 mRNA - Tandem 在体内的免疫效果，将 6 - 8 周龄的雌性 BALB/c 小鼠分为两组，分别肌肉注射 mRNA - Tandem - LNPs（剂量：30μg）或空 LNP（作为对照组，n = 6）。免疫方案包括初次免疫和加强免疫。随后收集血清样本于 - 20°C 保存，在第 42 天收获脾脏淋巴细胞，通过酶联免疫斑点试验（ELISpot）和流式细胞术分析细胞免疫反应。
10. 猪实验：选取 12 只 8 周龄的雌性猪，分为未接种疫苗的对照组和接种 mRNA - Tandem - LNPs（剂量：180μg）或空 LNP（n = 6）的实验组。免疫方案包括两次初始免疫和一次加强免疫。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清样本评估体液免疫反应，分离外周血单个核细胞（PBMCs）进行 ELISpot 试验评估细胞免疫反应。ELISA 实验中，血液凝固后分离血清进行分析。
11. ELISA：通过 ELISA 评估 IgG 表达。将 96 孔 ELISA 板用 2μg/mL 的各蛋白（B602L、CD2V、EP153R、P30、P54 和 P72）包被，4°C 孵育过夜。用 5% BSA 在 PBST 中 37°C 封闭 1h，防止非特异性结合。经 PBST 洗涤两次后，加入稀释的小鼠血清室温孵育 2h，再洗涤 3 次。加入 1:10000 稀释的 HRP 标记的抗小鼠 IgG 抗体，随后加入 TMB 底物显色，使用 Synergy HTX 微孔板读数仪在 450nm 处测定吸光度。
12. ELISpot：小鼠脾脏细胞通过将脾脏碾碎过细胞筛制备，用 ACK 裂解缓冲液裂解红细胞后，用 PBS 充分洗涤，处理后细胞活力 > 90%。使用 Mouse IFN - γ Precoated ELISpot Kit，按照说明书检测 T 细胞对表位的免疫反应。将细胞以 4×10⁵个 / 孔的密度铺板，每孔终体积 100μL RPMI 160，加入预测的 T 细胞表位肽（共 17 种，终浓度 10μg/mL）作为刺激物，孵育 18h。细胞经冷水孵育 10min 裂解，洗涤后用生物素化的抗小鼠 IFN - γ 抗体和链霉亲和素 - HRP 结合物检测斑点，使用 ELISpot Reader System 进行定量分析，斑点计数标准化为每百万个细胞的数量，并绘制重复孔的平均值。猪实验中，使用 PBMCs 替代脾脏细胞进行 ELISpot 试验，PBMCs 通过密度梯度离心从猪外周血中分离，洗涤后重悬于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中，以 4×10⁵个细胞 / 孔的密度铺板，与预测的 T 细胞表位肽（终浓度 10μg/mL）在 100μL RPMI 1640 中孵育 18h，后续步骤与小鼠实验相同。
13. 流式细胞术：使用制备的脾脏细胞在多色流式细胞仪上分析抗原特异性 T 细胞反应。将细胞计数后以 200 万个 / 孔（100μL）加入，用 T 细胞表位混合物刺激 8h，37°C 孵育，然后加入布雷菲德菌素 A（Brefeldin A）继续孵育 4h。刺激后的细胞用含 0.5% BSA 的 PBS 洗涤，使用 TruStain FcXTM 抗体减少细胞表面非特异性染色。用 APC/Fire 750 抗小鼠 CD3 抗体、FITC 抗小鼠 CD4 抗体和 Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD8a 抗体标记 T 细胞表面标志物，然后用 Fixation/Permeabilization Solution Kit 固定细胞，分别用 PE 抗小鼠 IFN - γ、PE 抗小鼠 IL - 2 和 PE 抗小鼠 IL - 4 抗体染色。使用 FlowJo（V10.0.7）分析数据，CD4 和 CD8 T 细胞的流式细胞术设门策略及所用抗体的克隆信息分别见相关文件。
14. 统计分析：使用 GraphPad Prism 8.0 进行数据分析，所有实验数据以平均值 ± 标准误差表示。由于样本量和测试组数较少，所有统计分析均采用 t 检验，*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001 表示差异具有统计学意义。

三、结果

1. mRNA 鸡尾酒疫苗的设计和表征：mRNA 疫苗通常包含 Cap、3’和 5’UTR、ORF 和 Poly - A 尾。本研究的 mRNA 疫苗使用统一的 Cap 1，特定的 3’和 5’UTR 以及 100nt 的 Poly - A 尾。ORF 中整合了 6 种 ASFV 抗原（B602L、CD2V、EP153R、P30、P54 和 P72），并添加了一系列增强元件，如分泌信号肽促进蛋白分泌，分子佐剂 tuftsin（Thr - Lys - Pro - Arg）和 H - 2Kd（TYQRTRALV）增强细胞免疫反应，以及 His 标签便于蛋白检测。对于抗原 P72 的 mRNA，还引入了 T4 噬菌体纤维蛋白的三聚化基序，期望诱导 P72 三聚体结构的形成。构建的序列导入 pVAX1 载体，通过 T7 聚合酶介导的体外转录合成 mRNA 疫苗，使用 N1 - 甲基 - 假尿苷替代尿苷。毛细管电泳显示合成的 mRNA 分子完整性良好。mRNA 通过微流控系统与 LNP 包封用于体内递送，动态光散射检测所得颗粒的平均粒径约为 80nm，多分散指数低于 0.2，mRNA - LNP 的包封效率高于 95%。转染 HEK293T 细胞后，通过抗 His 抗体检测到目标蛋白的表达。
2. mRNA 鸡尾酒疫苗在小鼠中诱导的免疫反应：对实验小鼠进行 3 次免疫，每周采血检测抗体。评估体液免疫反应的指标包括几种已知能在当前疫苗中产生抗原特异性抗体的靶蛋白。在第二次免疫后 28 天和第三次免疫后 14 天处死小鼠，取脾脏细胞进行 ELISpot 试验和流式细胞术分析。用鸡尾酒中靶蛋白的选定 T 细胞表位刺激小鼠脾脏细胞过夜，评估细胞免疫反应和相应细胞因子的分泌。

接种疫苗的小鼠在第一次免疫后 7 天开始产生大量抗 P30 抗体，第二次免疫后 7 天达到峰值，此后 4 周保持稳定。针对其他抗原（如 P54 和 P72）的抗体水平在第二次免疫后 21 天达到峰值，最终产生高水平的抗 P72 抗体。然而，小鼠血清对 P54 和 CD2V 抗原的反应较弱，第三次加强免疫后 7 天，相应抗体水平变化不大。

先前研究表明，病毒特异性 T 细胞免疫反应对控制 ASFV 感染至关重要。ELISpot 试验检测脾脏细胞分泌干扰素 - γ（IFN - γ）的能力，以评估疫苗是否诱导细胞免疫反应。结果显示，第二次免疫后 28 天，接种疫苗组小鼠的脾脏细胞平均产生 655 个斑点，第三次免疫后 14 天，平均产生 4870 个斑点，疫苗组的 IFN - γ 分泌水平明显高于对照组。这表明接种疫苗的小鼠对抗原产生了记忆，疫苗可诱导细胞免疫反应，且加强免疫可增强这种反应。

通过流式细胞术检测小鼠脾脏细胞中 CD4⁺和 CD8⁺细胞的比例，同时对 IL - 2、IL - 4、IFN - γ 和 TNF - α 进行细胞内细胞因子染色，检测表位刺激后分泌的细胞因子。结果发现，与生理盐水处理的小鼠相比，接种疫苗小鼠的 CD4⁽⁺⁾和 CD8⁽⁺⁾脾细胞在相应肽刺激后，细胞内 IL - 4、IFN - γ 和 TNF - α 的产生量显著更高，而 IL - 2 在 CD4⁽⁺⁾T 细胞中的产生量较高，在 CD8⁽⁺⁾T 细胞中的产生量较低。
3. mRNA 鸡尾酒疫苗在猪中诱导的生理和免疫反应：在猪中测试疫苗的安全性和有效性，对猪进行 3 次免疫，每次间隔 14 天。每天记录每头猪的体温，每 7 天采集外周血，同时在每次间隔时对猪称重。通过 ELISA 和 ELISpot 方法检测疫苗在猪中诱导体液和细胞免疫反应的能力。

在接种疫苗期间，4 头免疫猪均未死亡。实验猪的体温在免疫期间有所波动，但总体体温在 38.2 - 40.2°C 的正常范围内。所有猪在免疫期间体重稳步增加，疫苗组和对照组猪的体重无显著差异，表明疫苗不影响猪的体重。

疫苗在猪和小鼠中诱导针对不同抗原的抗体产生时间和水平略有不同。猪对 P30 的抗体水平在第二次免疫后 7 天才开始升高，此后维持在较高水平。对 P72 的抗体水平稳步上升，在第三次免疫后 7 天达到峰值并稳定。第二次免疫后 7 天，免疫组开始产生针对 CD2V 和 P54 的抗体，但总体抗体水平仅略高于对照组。此外，疫苗在猪中也能诱导细胞免疫反应。第二次免疫后 7 天，检测猪的 PBMCs，用选定的表位肽刺激，疫苗组分泌的 IFN - γ 平均水平约为对照组的 6 倍。通过 ELISpot 试验评估每个抗原预测的 T 细胞表位肽刺激细胞诱导的 IFN - γ 分泌，检测到的产生 IFN - γ 的 T 细胞斑点计数见相关文件。

总体而言，这些结果表明，这种 mRNA 疫苗组合可诱导多价体液免疫反应和强大的 T 细胞反应，为控制 ASFV 感染提供了有前景的候选疫苗。

四、讨论

ASFV 具有高度传染性和致死性，对全球养猪业影响巨大，目前尚无有效的商业疫苗，这使得 ASF 的防控面临严峻挑战，尤其是在养猪大国。鉴于 ASFV 感染的复杂性和对广泛有效免疫反应的需求，当前疫苗开发策略通常选择多种靶抗原进行免疫。细胞免疫在对抗 ASFV 感染中起着关键作用，mRNA 疫苗（尤其是与 LNP 配制时）在引发细胞免疫方面具有潜力，且其 ORF 为抗原修饰和适应提供了灵活性。mRNA 疫苗具有安全性好、免疫原性强、生产成本低和研发速度快等优势，特别适合基于靶抗原的 ASFV 疫苗研发。

本研究选择并组合了 6 种 ASFV 靶抗原（B602L、CD2V、EP153R、P30、P54 和 P72），加入佐剂等元件，制备了 mRNA 鸡尾酒制剂。ASFV 的 B602L 蛋白与 Fc 片段融合后免疫原性增强，能促进猪肺泡巨噬细胞中抗原呈递相关蛋白和多种细胞因子的 mRNA 表达，诱导 Th1 偏向的细胞免疫和体液免疫反应，是 mRNA 疫苗构建的有前景的候选成分。