大肠杆菌胞外囊泡靶向不同细菌，抑制细胞分裂并降低其致病性：开拓抗菌新视野

本文研究发现大肠杆菌胞外囊泡（EVs）能抑制化脓性链球菌（GAS）生长，通过抑制肽聚糖（PG）重塑导致细胞分裂缺陷，还改变 GAS 基因表达，降低其致病性。这为理解细菌间相互作用及开发新型抗菌剂提供了重要依据。

　　

研究背景

大多数细菌在正常生长过程中会自然释放 20 - 400nm 大小的球形脂质双层胞外囊泡（EVs）。EVs 的形成和释放有组成型或调节型等多种机制，其包含蛋白质、核酸等多种物质，在细菌与宿主相互作用、细菌间通讯等多个生物学过程中发挥重要作用，比如参与毒力调节、营养获取、水平基因转移等。细菌之间存在合作和竞争的相互作用，如群体感应是细菌间的合作行为，而细菌还拥有多种竞争系统来消除其他细菌物种。近年来研究发现，EVs 在细菌相互作用中也发挥着重要作用，它可以传递蛋白质、遗传物质等，但目前其在不同物种间相互作用的生理和生态意义尚未完全明确。

研究目的

本研究旨在进一步探究 EVs 在不同物种间的生理效应和意义，以化脓性链球菌（GAS）为模型，深入研究大肠杆菌 EVs 对 GAS 的影响机制，为预防和治疗 GAS 感染提供新的思路。

研究结果

1. 大肠杆菌 EVs 抑制多种革兰氏阳性菌生长：研究人员检测了大肠杆菌 EVs 对多种细菌生长的影响，发现其对所有检测的革兰氏阳性菌（如化脓性链球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）均有显著的生长抑制作用，对大肠杆菌自身生长无影响，且对化脓性链球菌的抑制作用尤为明显。通过生长曲线测定和 Live/Dead 染色实验表明，大肠杆菌 EVs 对化脓性链球菌具有抑菌作用，且不损伤细胞，可能是 EVs 本身或其携带的分子参与了生长抑制过程。
2. 大肠杆菌 EVs 诱导 GAS 细胞分裂缺陷并形成多个隔膜：利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察发现，经大肠杆菌 EVs 处理后的 GAS 细胞形态发生改变，出现部分膨胀和非均一的球形结构，细胞内形成多个隔膜。通过对表达 ftsZ - mNeonGreen 融合蛋白（FtsZ - mNG）的 GAS 进行研究发现，EVs 处理会导致多个 Z 环和隔膜在细胞长轴附近形成，干扰细胞伸长和分离，进而导致细胞分裂缺陷。
3. 大肠杆菌 EVs 抑制 PG 重塑：肽聚糖（PG）是细菌细胞壁的主要成分，对细胞分裂和形态维持至关重要。研究人员通过用荧光 D - 氨基酸 HADA 标记新合成的 PG 发现，大肠杆菌 EVs 处理后的 GAS 细胞中，PG 合成过程出现异常，隔膜 PG 合成正常，但外周 PG 合成受阻，HADA 在隔膜处积累，无法扩散到外周，表明 EVs 抑制了 PG 重塑。通过氨苄青霉素诱导细胞裂解实验和 PG 酶谱分析进一步证实，EVs 处理降低了 GAS 中 PG 水解酶的活性，而非干扰 PG 合成，从而抑制 PG 重塑，最终导致细胞分裂缺陷和生长抑制。
4. 大肠杆菌 EVs 广泛改变 GAS 基因组的基因表达：对经大肠杆菌 EVs 处理和未处理的 GAS 进行 RNA - seq 分析，发现处理后的 GAS 在不同时间点存在大量差异表达基因（DEGs），且这些基因分布在整个基因组。随着处理时间延长，差异表达基因数量增加，4h 时约 10% 的 GAS 基因组基因表达受到影响，且多数基因被抑制。GO 富集分析显示，这些差异表达基因涉及多个生物学过程和分子功能，特别是碳水化合物代谢 / 转运、酶活性（如水解酶活性）和毒素活性等。其中，主要毒力相关基因如hasABC、slo、nga等表达显著下调，表明 EVs 可能会降低 GAS 的毒力。
5. 大肠杆菌 EVs 降低 GAS 的毒力活性并减弱其在小鼠体内的致病性：评估了 GAS 主要毒力因子的活性，发现经大肠杆菌 EVs 处理后，GAS 的 NAD 酶活性、溶血活性和透明质酸（HA）产量均显著降低。在小鼠皮肤感染模型中，用大肠杆菌 EVs 处理的 GAS 感染小鼠后，小鼠背部形成的病变面积明显小于未处理组，表明大肠杆菌 EVs 能有效抑制 GAS 在小鼠体内的致病性。

研究讨论

本研究表明大肠杆菌 EVs 可诱导靶细菌出现异常细胞分裂并抑制其生长，主要机制是影响 PG 水解酶活性，抑制 PG 重塑，进而导致细胞分裂缺陷。同时，EVs 还能大幅降低靶细菌的致病性，引起 GAS 约 10% 基因组的基因表达变化，抑制多种毒力相关基因的表达和活性。这一发现提示 EVs 可能作为一种新型抗菌剂，其抑菌作用不仅能抑制细菌生长，还能干扰细菌的多种关键功能。此外，虽然目前对 EV 介导的细菌间竞争了解有限，但本研究增强了人们对细菌 EVs 在自然环境中细菌种群网络中生理和生态重要作用的认识。

研究方法

1. 细菌菌株和培养条件：详细列出了研究中使用的细菌菌株和质粒，并说明了 GAS 的培养条件，包括培养基、温度以及必要时添加的抗生素等。
2. 大肠杆菌 EVs 的制备：采用特定方法从大肠杆菌中分离 EVs，包括离心、过滤、超离心和密度梯度纯化等步骤，最后测定 EVs 的蛋白质浓度并估计颗粒数量。
3. 生长实验：通过在不同浓度大肠杆菌 EVs 存在下培养 GAS，测定其在不同时间点的 OD₅₉₅nm 值，绘制生长曲线并计算倍增时间，评估大肠杆菌 EVs 对 GAS 生长的影响。
4. 荧光显微镜观察：对 GAS 细胞进行处理后，通过染色和免疫荧光标记，利用共聚焦显微镜观察细胞形态、DNA 和蛋白质定位等。
5. 时间 - lapse 显微镜观察：对细菌细胞膜进行染色后，在添加大肠杆菌 EVs 或缓冲液的条件下培养，每隔 10min 采集荧光图像，观察细胞分裂过程中 Z 环的形成。
6. 电子显微镜观察：制备经大肠杆菌 EVs 处理的 GAS 细胞样本，分别用于透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察，分析细胞形态和隔膜数量等。
7. Live/Dead 染色实验：使用 LIVE/DEAD BacLight 细菌活力试剂盒对处理后的 GAS 细胞进行染色，通过显微镜观察计算细胞活力。
8. EV 结合实验：用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记大肠杆菌 EVs，与 GAS 细胞孵育后观察两者的相互作用。
9. PG 标记实验：用荧光 D - 氨基酸 HADA 标记 PG，观察大肠杆菌 EVs 处理后 GAS 细胞中 PG 合成和动态变化。
10. PG 水解酶活性分析：通过酶谱凝胶实验检测 GAS 细胞中 PG 水解酶的活性。
11. 氨苄青霉素诱导细胞裂解实验：在氨苄青霉素存在下，比较经大肠杆菌 EVs 处理和未处理的 GAS 细胞的生长情况，评估 PG 合成和降解的平衡。
12. RNA 提取、RNA - seq 和生物信息学分析：提取经大肠杆菌 EVs 处理和未处理的 GAS 细胞的总 RNA，进行 RNA - seq 测序，对测序数据进行预处理和分析，鉴定差异表达基因，并进行 GO 富集分析。
13. 透明质酸定量实验：采用特定方法提取和定量 GAS 细胞产生的透明质酸。
14. 溶血实验：将处理后的 GAS 细胞与绵羊红细胞混合，测定溶血活性。
15. NAD 酶活性实验：检测 GAS 细胞培养上清液中 NAD 酶的活性。
16. 皮肤感染模型：利用小鼠皮下感染模型，评估经大肠杆菌 EVs 处理的 GAS 的致病性，通过测量小鼠背部病变面积来量化感染程度。