果蝇运动神经元放电稳态维持行为韧性的奥秘

本文聚焦果蝇幼虫，研究发现当运动神经元与肌肉间突触减弱时，运动神经元通过增加放电（源于兴奋性增强和抑制性中枢驱动减少）来补偿。这种稳态调节机制确保在突触传递变化时，果蝇仍能维持正常运动，为理解神经稳态调控提供新视角。

　　

研究背景

神经元的突触可塑性使其能对外界信号做出反应，调整输出，塑造神经元回路并影响行为。然而，这种灵活性在动物的整个生命周期中面临着诸多调节挑战。在发育过程中，突触连接会经历显著的结构和功能变化，包括广泛的生长、修剪和细化。同时，神经元的内在兴奋性也会因细胞大小的快速增长以及离子通道丰度和分布的改变而发生波动。成熟后，神经网络必须保持可塑性，以适应依赖经验的突触强化机制，如对学习和记忆至关重要的短期或长期增强作用。但如果这些依赖活动的（赫布型）突触强化不受控制，就可能产生正反馈回路和失控的兴奋，进而在神经回路中传播，导致网络不稳定。此外，即使突触的分子机制（如离子通道、受体和信号蛋白）不断更新，突触也必须维持稳定可靠的信号传递。因此，动物的行为要兼具适应性和一致性，就需要存在相互制衡的力量，以产生灵活性并维持稳定性。

神经系统通过多种稳态可塑性机制来实现这种平衡，这些机制能够稳定神经回路功能并调节细胞兴奋性。例如，它们可以使细胞恢复到放电设定点，恢复兴奋 - 抑制平衡，调节神经元的内在兴奋性，还能通过对突触前和突触后的调整确保可靠的回路输出。其中，最具代表性的两种稳态突触可塑性形式是突触缩放和突触前稳态可塑性（PHP）。突触缩放通过统一调整所有突触的强度（上调或下调），使神经元的整体活动回到目标范围内，同时保持突触的相对强度。而 PHP 主要在果蝇神经肌肉接头（NMJ）中发挥作用，它能通过突触前增加递质释放来补偿突触后反应的减弱。不同的稳态反应发生的时间进程各不相同，突触缩放通常需要数小时到数天，急性 PHP 只需几分钟，而内在兴奋性的调整则能在几秒内完成，且这些调整可以持续数天到数年。尽管在不同的模式生物中已经探索了多种稳态机制，但很少有研究在具有完整神经系统的行为动物中同时研究多种形式的稳态机制，而这种研究对于深入理解多种稳态调整的协调功能以及神经系统受到干扰后这些反应的时间进程具有重要意义。

研究方法

1. 果蝇品系构建：通过标准的胚胎注射生殖系转化技术生成转基因果蝇。所用果蝇品系包括来自不同实验室和果蝇品系中心的多种品系，如 24B - Gal4、GluRIIASP16、Df (2L) clh4、UAS - Shibire^TS1 、OK6 - Gal4、R70C01 - LexA 等。实验使用的果蝇在特定的温度下饲养，实验时选取雌雄两性的漫游三龄幼虫，且仅使用活跃爬行的幼虫。
2. 幼虫运动分析：采用六孔板，每孔填充 2% 琼脂糖凝胶，限制幼虫在 z 轴方向的运动，确保其在凝胶表面爬行。使用 CCD 相机在特定的光照和温度条件下以 10 帧 / 秒的速度记录幼虫 10 分钟的运动过程，利用自定义的 MATLAB 脚本分析幼虫运动的不同阶段，如主动爬行阶段和重新定向阶段，并计算速度、步长、重新定向时间等参数。
3. 突触光学定量成像：对三龄幼虫进行解剖，在特定的溶液中进行成像。使用 Vivo Spinning Disk Confocal 显微镜，配备相应的物镜、激光、滤光片和相机，通过刺激神经并同步成像，获取突触前膜释放递质引起的突触后膜 Ca^{2 +} 变化信号（SynapGCaMP6f 成像）。利用自定义的 MATLAB 程序对图像进行滤波、区域划分、运动和漂白校正等处理，计算释放概率、量子密度等指标。
4. 体内完整幼虫成像：将三龄幼虫置于定制的透气聚二甲基硅氧烷（PDMS）腔室中，以特定的方式固定后，使用 Axio Zoom.V16 显微镜进行成像。根据成像部位和目的选择不同的放大倍数，对背侧肌肉或腹神经索（VNC）进行成像，获取突触传递过程中的荧光信号变化，通过一系列图像处理步骤（如平移、仿射和非线性变换）稳定运动和收缩的 NMJ 图像，并计算相关参数，如活动爆发持续时间、达到最大荧光变化的时间、收缩位移、节段间延迟、爆发重叠时间等。

研究结果

1. 筛选影响 Ib 和 Is 突触神经传递的突触前缺陷：利用 MN 特异性 Gal4 驱动子 OK6，在 Ib 和 Is 运动神经元中条件性表达针对递质释放机制相关蛋白编码基因的 RNAi，通过光学量子分析评估对突触传递的影响。结果发现，敲低 Cac（电压门控 Ca^{2 +} 通道）、Syt1（Ca^{2 +} 传感器）、Rbp（RIM 结合蛋白）和 Unc - 13（突触小泡引发蛋白）会显著降低 Ib 和 Is 突触的量子密度，敲低 VGlut（突触小泡谷氨酸转运体）会降低 Ib 突触的量子密度。选择 Cac、Rbp 和 Unc - 13 的 RNAi 进行后续研究，并证实了这些 RNAi 能有效敲低突触前神经末梢的蛋白水平。
2. 突触前释放机制或突触后谷氨酸受体扰动对运动的影响：预期突触前释放减少或突触后受体功能减弱会导致运动输出缺陷，但无论是 GluRIIA^?/? 突变引起的突触后扰动，还是 Cac、Rbp 或 Unc - 13 的 RNAi 敲低引起的突触前扰动，幼虫都能存活至成虫阶段。详细分析幼虫的爬行行为发现，这些突触扰动对幼虫的平均速度、平均步长和重新定向阶段的平均持续时间影响较小，仅在量化幼虫敏捷性（如身体曲率和转向角度）时观察到较小的行为影响。这表明尽管突触传递减弱，但幼虫的运动行为仍能保持相对正常，暗示存在其他补偿机制。
3. 改变的神经肌肉传递动力学补偿突触减弱：利用限制爬行装置，在观察幼虫向前爬行蠕动行为的同时，测量运动神经元对肌肉的输入。通过成像突触后 SynapGCaMP6f，发现突触前释放机制敲低（Unc - 13、Rbp 和 Cac 的 RNAi）以及 GluRIIA^?/? 突变均会改变突触传递的时间模式，使活动爆发持续时间几乎翻倍，爆发上升阶段减慢，相邻节段的突触传递爆发时间重叠增加，而收缩位移和蠕动波传播速度与对照组相似。这些结果表明，每个动作电位（AP）释放的谷氨酸减少会诱导 AP 爆发持续时间和相邻节段爆发重叠增加，共同维持正常的肌肉收缩。
4. 活动补偿涉及 Ib 型运动神经元爆发持续时间的细胞自主增加：对 Is 突触进行高倍成像发现，与 Ib 突触不同，在突触传递受损的情况下，Is 突触的突触传递爆发时间模式没有变化，而 A1 节段的 Ib 突触在 Unc - 13、Cac 和 Rbp 的 RNAi 敲低以及 GluRIIA 缺失突变时，活动分数时间和爆发持续时间大约翻倍。通过成像突触前 Ib 型运动神经元轴突中的胞质 GCaMP6f，直接测量运动神经元的放电动力学，结果显示神经肌肉突触传递减弱的动物中，Ib 型运动神经元的活动分数时间和爆发持续时间均增加。此外，之前的研究发现，I 型运动神经元中 Unc - 13 或 Rbp 的敲低会降低一组电压门控 K⁺ （K_v）通道及其辅助亚基的表达，本研究中直接在 I 型运动神经元中敲低 Shab 或 Shaker（两种 K_v 通道），发现其效果与突触减弱相似，增加了 Ib 型运动神经元突触传递爆发持续时间和相邻节段的时间重叠，而节段间爆发延迟不变。这些结果表明，Ib 型运动神经元中 K_v 功能的降低通过增加兴奋性，有助于补偿神经肌肉传递的减弱。
5. 与运动神经元放电稳态相关的中枢前运动输入活动改变：关注运动神经元上游的前运动神经元（PMNs），聚焦于支配特定 Ib 型运动神经元（MN1 - Ib、MN2 - Ib、MN9 - Ib 和 MN10 - Ib）而不支配相同肌肉的 Is 型运动神经元（MNISN）的 PMNs，包括 PMSIs（period - positive median segmental interneurons，也称为 A02 细胞）、A18a 和 A31b 细胞。利用 R70C01 - LexA 驱动子在 PMSIs 中表达胞质 GCaMP6m，同时在 I 型运动神经元中用 OK6 - Gal4 驱动 UAS - RNAi 敲低 Unc - 13、Rbp 或 Cac，成像发现，在对照组动物的 PMSIs 中，观察到规则的抑制性活动爆发，而在释放机制敲低的动物中，PMSI 活动显著降低，包括蠕动波频率、爆发频率和活动分数时间减少，但爆发持续时间和幅度不变，节段间爆发起始延迟也不受影响。这表明运动神经元与肌肉突触传递减弱的动物中，Ib 型运动神经元的放电增加涉及上游回路调整，减少了对 Ib 型运动神经元的抑制性驱动。
6. Ib 型运动神经元稳态放电调整的时间进程：由于 PhTox 难以引入完整幼虫，且 GluRIIA 基因操作后表达变化缓慢，因此利用温度敏感的果蝇动力蛋白突变体 shibire^ts1 （shi^ts1）进行研究。在 18°C 的允许温度下饲养表达 UAS - shi^ts1 的幼虫，然后转移到 26°C 的限制温度下，成像观察发现，在限制温度下，表达 shi^ts1 的幼虫运动在 10 - 20 分钟后开始下降，20 - 30 分钟后停止，突触传递爆发幅度在 20 - 30 分钟后显著下降，而突触传递爆发持续时间在 30 - 40 分钟后增加。这表明 Ib 型运动神经元活动模式的稳态变化在急性突触前谷氨酸释放减少后 10 - 20 分钟发生。

研究讨论

1. 稳态机制对运动神经元活动的补偿作用：神经系统中的稳态机制通过调节突触传递和兴奋性，维持兴奋与抑制的平衡，确保神经回路的正常功能。果蝇幼虫神经肌肉接头处的 PHP 通过逆行信号系统增加递质释放，补偿突触后对递质敏感性的降低，但在 GluRIIA^?/? 突变的情况下，PHP 仅部分补偿，且仅发生在 Ib 型运动神经元输入中。研究发现，无论是突触前谷氨酸释放减少还是突触后 GluRII 功能降低，幼虫都会增加运动神经元爆发持续时间和活动分数时间。与脊椎动物骨骼肌的全或无收缩动力学不同，果蝇幼虫体壁肌肉对不同的运动神经元放电频率呈现分级反应，这使得幼虫能够通过增加运动神经元放电来实现与野生型幼虫相同的收缩力。这种调整发生在 Ib 型运动神经元中，而不是 Is 型运动神经元，且爬行速度由蠕动波频率而非步长调节，因此在突触前和突触后减弱的幼虫中，蠕动波速度和频率得以保持，维持了正常的爬行速度。此外，Ib 型运动神经元突触传递爆发持续时间的增加抵消了单个 AP 触发的突触后 Ca^{2 +} 内流减少，表明稳态机制有助于维持突触后密度处的细胞内 Ca^{2 +} 积分设定点。
2. 运动神经元放电增加的双重机制：突触减弱触发的运动神经元活动和递质释放的补偿性增加似乎由两种平行的稳态机制介导。第一种机制是运动神经元的细胞自主变化，使其兴奋性增加。研究发现，I 型运动神经元中 Unc - 13 或 Rbp 的敲低会降低一组 K_v 通道基因模块的表达，直接敲低 Shab 或 Shaker 会产生与突触减弱类似的效果，增加 Ib 型运动神经元爆发持续时间，表明 Ib 型运动神经元中 K_v 功能降低有助于补偿性延长活动爆发。第二种机制是 PMSIs 活动的变化，PMSIs 为 Ib 型运动神经元提供中枢抑制性前运动神经元输入，但不支配 Is 型运动神经元。在突触减弱的动物中，PMSIs 的运动相关爆发活动减少，这与之前的研究结果一致，即光遗传刺激增加 PMSIs 活动会缩短运动神经元爆发持续时间。因此，突触传递减弱会触发双向变化，增加 Ib 型运动神经元的放电：一方面是 Ib 型运动神经元兴奋性的细胞自主增加，另一方面是减少对 Ib 型运动神经元抑制性输入的回路调整。放电稳态和 PHP 相互补充，共同维持神经肌肉传递的稳定。
3. 潜在的信号检测和传递途径：幼虫神经系统检测谷氨酸能传递和肌肉收缩缺陷的位点和机制，以及该信号如何在网络中向上游传递以改变兴奋性和放电模式，仍有待确定。研究提出了两种可能的途径：一是两步逆行突触信号机制，涉及从肌肉到运动神经元，再从运动神经元到前运动神经元的逆行突触信号传递，可能涉及 Sema2b 到 PlexB 的分子机制，协调控制每个 AP 的递质释放和 AP 数量；二是来自外周的感觉反馈到中枢神经系统，幼虫本体感受系统中的多树突感觉神经元可能检测肌肉收缩缺陷，并驱动前运动神经元和运动神经元兴奋性的补偿性变化，已有研究表明其失活会增加运动神经元放电持续时间。
4. Ib 和 Is 输入的功能特点及协同作用：Ib 型输入的突触释放概率较低，活动缓慢上升和下降，而 Is 型输入的突触释放概率较高，活动开启和关闭迅速，仅在最大收缩阶段爆发。PHP 和放电稳态对 Ib 型运动神经元的输入选择性使 Is 型运动神经元能够保持恒定，确保稳定的运动波动力学，而 Ib 型运动神经元的适应性输入则提供了可塑性，以适应不断变化的条件。这些机制共同实现了稳定性和灵活性的平衡，支持了强大的运动行为。