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睾丸胎儿 Leydig 细胞对男性生殖发育至关重要，但其分化机制不明。研究人员以小鼠为模型，用单细胞核多组学等技术研究 Nr2f2 在间质细胞向胎儿 Leydig 细胞转变中的作用。结果发现 Nr2f2 阳性细胞是祖细胞，敲除 Nr2f2 会致性别发育异常。该研究为相关疾病提供分子见解。
在生命的奇妙旅程中，男性生殖系统的正常发育是繁衍后代的关键一环。睾丸，作为男性生殖的核心器官，其内部细胞的分化与协作如同精密的交响乐。其中，胎儿 Leydig 细胞（fetal Leydig cells）承担着合成和分泌雄激素的重任，雄激素对于男性生殖管道的建立和第二性征的出现至关重要。然而，尽管胎儿 Leydig 细胞早在一个多世纪前就被发现，但其起源和分化机制却一直是科学界争论的焦点。目前，已知它被认为是由睾丸间质中增殖的祖细胞分化而来，但具体是哪一群间质细胞以及分化的详细分子机制仍不清楚。而且，胎儿 Leydig 细胞分化受损会导致一系列性别发育差异（differences of sex development，DSDs），如尿道下裂、隐睾症和不育症等，严重影响男性健康和生育能力 。为了揭开这些谜团，美国国立环境卫生科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）的研究人员开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解睾丸发育和相关疾病的发生机制提供了新的视角。
研究人员主要运用了单细胞核多组学（single-nucleus multiomics）、谱系追踪（lineage tracing）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和 RNA 测序（RNA-seq）等技术。研究样本主要来源于不同发育阶段的小鼠胚胎睾丸。
研究结果如下：
- 鉴定胚胎睾丸间质细胞群：通过对 E14.5 小鼠睾丸进行单细胞核 RNA 测序（RNA-seq）和染色质可及性测序（ATAC-seq），研究人员将获得的 7122 个细胞核分为 14 个不同细胞簇。其中，c0、c1、c5、c7 和 c10 簇表达间质细胞标记，被认定为潜在间质细胞，且各簇有独特标记组合。
- 确定潜在胎儿 Leydig 细胞祖细胞：基于 ATAC-seq 数据的分析显示，胎儿 Leydig 细胞（c3）与 c0 簇在染色质可及性上相近，轨迹分析也表明 c0 与 c3 存在发育关联，c0 表达间质细胞标记及参与细胞外基质组织的基因，提示 c0 可能是胎儿 Leydig 细胞祖细胞。整合不同发育阶段数据发现，Nr2f2 阳性类固醇生成祖细胞到胎儿 Leydig 细胞的分化程序在早期睾丸发育中较为保守。
- NR2F2 的表达与细胞分化关系：免疫荧光实验表明，NR2F2 在非类固醇生成间质细胞中表达，而不在胎儿 Leydig 细胞中表达。利用 Nr2f2-CreER 小鼠模型进行谱系追踪实验发现，Nr2f2 阳性间质细胞可分化为胎儿 Leydig 细胞，且这一分化过程在睾丸发育中持续存在。
- Nr2f2 敲除对睾丸发育的影响：构建 Nr2f2 条件性敲除小鼠模型（WT1creER; Nr2f2f/f），对 E14.5 睾丸进行研究。PCA 分析显示，敲除组与对照组转录组存在明显差异，敲除组中一些间质细胞标记和类固醇生成基因表达下调，导致睾丸间质细胞和胎儿 Leydig 细胞数量减少，睾丸变小。同时，敲除小鼠还出现双侧隐睾症和尿道下裂，这与胎儿 Leydig 细胞产生的激素（如 INSL3 和雄激素）减少有关。此外，敲除 Nr2f2 影响了间质细胞、胎儿 Leydig 细胞、免疫细胞和生殖细胞的正常功能。
- NR2F2 的调控机制：通过 NR2F2 ChIP-seq 实验，发现 NR2F2 结合位点富集在与 VEGF、TGF-β、EGF 和 Notch 信号通路相关的染色质区域，表明 NR2F2 通过调节这些信号通路维持间质细胞祖细胞状态，抑制胎儿 Leydig 细胞分化。同时，研究还鉴定出一些在间质细胞向胎儿 Leydig 细胞分化过程中起重要作用的转录因子。
研究结论和讨论部分指出，该研究利用多种技术深入剖析了胚胎睾丸的细胞景观，明确了 Nr2f2 阳性细胞是收缩细胞和胎儿 Leydig 细胞的祖细胞，凸显了 NR2F2 在睾丸发育中的关键作用。敲除 Nr2f2 导致的小鼠表型与人类 NR2F2 突变相关的 DSDs 相似，这为研究人类相关疾病提供了重要的动物模型。此外，研究还发现尽管敲除 NR2F2 去除了其对胎儿 Leydig 细胞分化的抑制作用，但胎儿 Leydig 细胞数量反而减少，暗示还存在其他促进分化的转录因子有待发现。研究鉴定出的关键转录因子为进一步研究睾丸发育和相关疾病的发病机制提供了新的方向，有助于开发针对 NR2F2 相关 DSDs 的诊断和治疗方法，对推动生殖医学领域的发展具有重要意义。
