探秘结核杆菌甘露糖基转移酶 PimE：解锁糖脂生物合成机制与抗结核新策略

结核病（TB）由结核分枝杆菌（Mtb）引发，是全球传染病致死的主要原因之一。Mtb 的致病性与其细胞包膜中的磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIMs）密切相关，PimE 参与 PIMs 的生物合成，但底物识别和催化机制不明。研究人员解析了 PimE 的结构，明确关键残基和催化机制，为抗 TB 治疗提供潜在策略。

　　结核病，这个古老又顽固的 “健康杀手”，多年来一直威胁着全球人类的生命健康。在 2023 年，它更是夺走了 125 万人的生命，让 1080 万人深受病痛折磨，超越新冠成为最致命的传染病。罪魁祸首结核分枝杆菌（Mtb）之所以如此 “嚣张”，很大程度上是因为其复杂的细胞包膜，其中磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIMs）起着关键作用。PIMs 不仅能维持细胞包膜的完整性、调节其通透性，还在宿主与病原体的相互作用中 “兴风作浪”。而甘露糖基转移酶 PimE 负责催化 PIMs 合成过程中添加第五个甘露糖残基的关键步骤，不过，它识别底物的结构基础和催化机制却一直像迷雾一样，让科研人员难以捉摸。

为了揭开这层神秘的面纱，来自哥伦比亚大学欧文医学中心、伦敦大学学院等多个研究机构的研究人员携手合作，开展了一项深入的研究。他们通过一系列的实验和分析，成功解析了 PimE 的冷冻电镜（cryo - EM）结构，包括其空载（apo）形式和与产物结合的形式，明确了参与底物配位和催化的关键残基，并通过体外实验和体内互补实验进行了验证，还借助分子动力学模拟揭示了底物的进入途径和结合动力学。这些成果意义重大，为理解 PimE 的功能提供了全面的视角，也为开发潜在的抗结核治疗策略点亮了一盏明灯。该研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是冷冻电镜技术，通过该技术获取 PimE 的高分辨率结构；二是分子动力学模拟，以此探究底物与 PimE 的相互作用动态；三是定点突变和体内互补实验，用于验证结构和计算结果，明确关键残基在催化过程中的作用。

一、结构测定
为了找到适合进行结构研究的对象，研究人员对 15 种分枝杆菌的 PimE 同源物进行筛选，最终选定脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）的 PimE（MaPimE）。他们将 MaPimE 在大肠杆菌中表达，经纯化、重构到脂质纳米圆盘后，利用冷冻电镜收集数据并处理，成功获得了 apo 形式 MaPimE 的 3.0 ? 分辨率结构。该结构显示，MaPimE 含有 12 个跨膜螺旋，N 端和 C 端都位于细胞膜的细胞质侧，还包含多个连接环和近膜螺旋。同时，通过结构同源性分析发现，PimE 属于 GT - C 超家族的糖基转移酶，与酵母葡萄糖基转移酶 ALG6、细菌阿拉伯糖基转移酶 ArnT 等具有较高的结构同源性。

二、底物结合腔的确定
研究人员在 PimE 中发现了一个位于跨膜结构域和周质之间的显著腔，呈腰果状，几乎与膜平面平行。根据其位置和结构特征，推测该腔为底物结合位点。腔的中央部分亲水性强且高度保守，含有预测的催化残基 D58。通过分析发现，腔的一端 CE1 可能是供体底物多萜醇磷酸甘露糖（PPM）的入口，另一端 CE2 则可能是受体底物 Ac_1/2PIM4 的入口。

三、反应产物结合的 MaPimE 的冷冻电镜结构
为了验证上述假设并深入了解催化机制，研究人员在 MaPimE 纯化的纳米圆盘掺入阶段添加 Ac₁PIM4 和 PPM，确定了其与产物结合的结构。该结构与 apo 结构总体拓扑相似，但在中央腔观察到两个可解释的密度，分别对应 PPM 的部分和产物 Ac₁PIM5。同时，发现结合产物后，PimE 的一些环发生了有序化和构象变化，这可能有助于底物定位和稳定。

四、配体相互作用的结构和计算见解
通过对 PimE 与配体相互作用的研究，发现 PimE 与底物和产物之间存在复杂的相互作用网络。关键残基 D58 与 Ac₁PIM5 的第五个甘露糖的 C2 羟基形成氢键，还有多个残基分别与底物和产物的不同部分相互作用。分子对接和 RoseTTAFold 建模进一步揭示了与全长底物的潜在相互作用，粗粒化分子动力学（CG - MD）模拟也为底物结合和进入机制提供了更多证据。

五、基于结构的 PimE 突变体的功能表征
研究人员设计了特定的突变体，在耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）ΔpimE 中进行体内互补实验，并通过体外酶促实验进行验证。结果表明，影响底物配位和催化的关键残基突变会导致酶活性改变，如 D58A、D58N 等突变完全丧失活性，而一些突变则导致活性降低。这些结果与结构和计算分析结果一致，进一步证实了关键残基在 PimE 功能中的重要性。

六、底物进入和催化机制
研究发现 PimE 的催化不依赖金属离子，基于此提出了其催化机制：PPM 通过 IL7 形成的拱形结构进入活性位点，其磷酸基团与 K195 和 H322 等残基相互作用；Ac₁PIM4 的糖头部分靠近催化碱基 D58，酰基链伸向 TM 螺旋 3。D58 作为催化碱基，使 Ac₁PIM4 的 2 - OH 基团去质子化，引发对 PPM 异头碳的亲核攻击，形成 α(1→2) 糖苷键，生成 Ac₁PIM5 和副产物 PP。

在结论与讨论部分，该研究成功解析了 MaPimE 的高分辨率结构，揭示了其底物结合特性和催化机制。PimE 独特的底物结合腔和催化机制，为开发针对 PimE 的小分子抑制剂提供了潜在的结合位点。鉴于 PIM 生物合成途径在分枝杆菌中的高度保守性，这些发现有望拓展到其他临床相关的分枝杆菌，为基于结构的抗结核药物设计奠定坚实基础，为攻克结核病这一全球性健康难题带来新的希望。