编辑推荐：
结核病（TB）由结核分枝杆菌（Mtb）引起，耐药菌株的出现使防控面临挑战。Mtb 细胞壁的阿拉伯聚糖对其生存和致病至关重要，AftB 在其合成中起关键作用。研究人员解析了 AftB 结构，揭示其催化机制，为抗结核药物研发提供新方向。
结核病，这个曾经令人闻风丧胆的 “白色瘟疫”，在现代医学的围剿下本应节节败退，然而现实却不容乐观。结核分枝杆菌（Mtb）的耐药菌株不断涌现，让结核病的防治陷入困境。Mtb 之所以如此 “顽强”，很大程度上得益于其独特的细胞包膜，这层 “铠甲” 不仅能抵御宿主的免疫攻击，还让许多抗生素无功而返。在这层包膜中，阿拉伯聚糖是关键角色，它对维持细胞壁的结构和功能至关重要。而阿拉伯糖基转移酶 AftB，作为阿拉伯聚糖生物合成的 “幕后推手”，催化着 β-(1→2) 连接的末端阿拉伯呋喃糖残基的添加，对 Mtb 的致病性影响深远。但一直以来，AftB 的结构和功能机制却如同迷雾，阻碍着科研人员深入了解 Mtb 的致病奥秘，也限制了新型抗结核药物的研发。
为了拨开这层迷雾，来自哥伦比亚大学欧文医学中心、英国华威大学等多个研究机构的研究人员携手合作，开展了一项极具意义的研究。他们深入剖析 AftB 的结构和功能，旨在为抗结核药物的研发开辟新道路。最终，研究成果发表在《Nature Communications》上，为全球抗击结核病带来了新希望。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：
- 冷冻电镜技术（cryo-EM）：通过该技术，研究人员获得了耻垢分枝杆菌（Mycobacterium chubuense）AftB 的 apo 形式和与供体底物类似物结合状态下的结构，分辨率分别达到 2.9 ? 和 3.4 ? ，为后续深入研究提供了关键的结构基础。
- 生物化学分析：采用适配的阿拉伯糖基转移酶测定法，验证了重组 AftB 的活性，并利用质谱分析等手段对反应产物进行分析，确定了 AftB 催化产物的结构和特征。
- 分子动力学模拟（MD simulations）：结合粗粒度和原子分辨率的 MD 模拟，研究人员探究了底物与 AftB 的结合模式和相互作用机制，进一步揭示了 AftB 的催化过程。
下面来详细看看研究结果：
- AftB 的结构测定：研究人员从 45 种分枝杆菌中筛选出 Mycobacterium chubuense AftB（McAftB）作为结构研究的对象。通过冷冻电镜技术，构建了 McAftB 几乎完整的原子模型，发现其由跨膜（TM）结构域和周质帽结构域组成，TM 结构域包含 11 个 α- 螺旋，周质帽结构域由 α- 螺旋和 β- 链构成。
- AftB 的整体结构：AftB 的 TM 螺旋通过胞质环和周质环连接，周质环中的 PL1、PL2 和 PL3 结构较为复杂。其 C 端周质结构域呈穹顶状，覆盖在 TM 螺旋束上，由两个叶状结构组成，PL5 作为连接两者的桥梁。此外，研究人员还观察到 Fab-B3 与 AftB 的周质结构域特异性结合，其结合界面存在大量氢键。
- AftB 的保守 GT-C 折叠：经 DALI 服务器分析，AftB 属于 GT-CA超家族的糖基转移酶，其前七个跨膜螺旋采用 GT-C 糖基转移酶折叠。不过，AftB 也有独特之处，如 TM 螺旋 3 和 10 分别分裂为短 α- 螺旋和 β- 链，形成小的反平行 β- 片层，这种结构差异的功能意义还有待进一步研究。
- AftB 的底物结合腔：AftB 中存在一个管状腔，从周质空间延伸至脂质膜，被认为是底物进入的通道。腔内的保守天冬氨酸残基 D62 对催化至关重要，D62A 突变体完全丧失酶活性。分子动力学模拟显示，供体底物 DPA 优先结合在由 TM 螺旋 5、6、7 和 JM 螺旋 1、2、4 定义的腔内，而受体底物 terminal-Araf4则从周质侧快速结合到靠近 β3 和 α4、β4 和 α5、α5 和 α6 连接环的位置。
- 2F-FPA 结合的 AftB 的冷冻电镜结构：研究人员解析了 AftB 与供体类似物 2F-FPA 结合的冷冻电镜结构，发现 2F-FPA 的糖环深入底物腔，其疏水酰基链沿 TM 螺旋 6 延伸，磷酸基团与 R221、R372 等残基相互作用。多个与 2F-FPA 相互作用的残基在分枝杆菌 AftB 同源物中高度保守，这些残基的突变会导致 AftB 催化活性丧失。
- 底物结合引起的结构重排：比较 apo 和 2F-FPA 结合的 AftB 结构发现，底物结合主要引起周质结构域的构象变化，TM 螺旋 7 和 11 向内移动，PL5 移位，进而引发周质结构域向膜的钳状运动，底物结合腔内的残基也向 2F-FPA 移位，使 AftB 形成更紧密的构象。
- DPA 和受体结合模式的研究：通过配体对接、蛋白质 - 配体共折叠和 MD 模拟，研究人员发现天然 DPA 底物与 2F-FPA 在 AftB 中的结合模式相似，且确定了一些与受体底物 terminal-Araf4结合相关的关键残基，如 F448 和 Y449，它们的突变会导致酶活性完全丧失。
在研究结论和讨论部分，研究人员确定了 AftB 的结构，它属于 GT-CA亚类糖基转移酶，其不规则的管状腔连接两个底物结合位点，为底物结合和催化机制的研究提供了重要线索。基于结构分析和功能实验，研究人员提出 AftB 可能通过双位移机制进行催化，D62 作为催化亲核试剂发挥关键作用。AftB 的底物结合腔结构适应了其结合不同阿拉伯聚糖受体底物的需求，有助于完成阿拉伯半乳聚糖（AG）和脂阿拉伯甘露聚糖（LAM/AM）的生物合成。此外，AftB 在不同分枝杆菌物种间结构高度保守，这表明从 Mycobacterium chubuense AftB 结构获得的见解可推广到其他分枝杆菌同源物。与其他分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶相比，AftB 的结构和功能具有独特性，反映了其在阿拉伯聚糖生物合成不同阶段的特殊作用。AftB 作为结核分枝杆菌细胞壁生物合成的关键酶，是潜在的抗结核药物靶点，针对 AftB 的研究可能为对抗耐药和敏感的分枝杆菌病原体提供新途径，为开发新型抗结核药物奠定了坚实基础，有望在未来结核病防治中发挥重要作用。
