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腺病毒衣壳主要由六邻体（hexon）组装而成，其折叠和组装依赖病毒编码的伴侣蛋白 100K，但 100K 的结构和作用机制未知。研究人员解析了 100K 与未成熟 hexon 三聚体的冷冻电镜结构，明确了二者相互作用关键位点及 100K 功能，为深入理解腺病毒组装提供依据。
在微观的病毒世界里，腺病毒是一种极具影响力的存在。它是一种二十面体、无包膜的 DNA 病毒，能感染人类和其他动物。腺病毒的衣壳主要由六邻体（hexon）组装而成，hexon 的正确折叠与组装对于病毒的感染和传播起着至关重要的作用。然而，长期以来，hexon 折叠和组装过程中依赖的病毒编码伴侣蛋白 100K，其详细结构和分子伴侣机制却如同迷雾一般，困扰着科研人员。这一知识缺口限制了人们对腺病毒生命周期的深入理解，也阻碍了相关抗病毒策略的开发。
为了揭开这层神秘的面纱，来自清华大学、山西医科大学等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了关于腺病毒编码的伴侣蛋白 100K 在衣壳折叠和组装中分子机制的研究。最终，研究取得了重大突破，相关成果发表在《Nature Communications》上。该研究不仅解析了 100K 与未成熟 hexon 三聚体的复合物结构，还明确了 100K 与 hexon 相互作用的关键位点及其在 hexon 折叠和组装中的重要功能，为理解腺病毒的组装过程提供了关键线索，也为抗病毒研究开辟了新的方向 。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是冷冻电镜技术（cryoEM），通过该技术解析 100K 与 hexon 复合物的结构；其次是蛋白质纯化技术，用于获取实验所需的 100K 和 hexon 蛋白；最后是定点突变技术，通过构建多种 100K 和 hexon 的突变体，验证它们之间相互作用位点的功能。
研究结果
- 腺病毒 100K-hexon 复合物的纯化与结构测定：研究人员在 HEK293F 细胞中共表达腺病毒 3 型（ad3）hexon 和 2 型（ad2）100K，利用亲和层析纯化得到 100K-hexon 复合物。通过冷冻电镜单颗粒分析，最终解析出该复合物整体分辨率为 3.23 ? 的结构，其中 100K 部分经聚焦优化后分辨率提升至 3.79 ?。同时，还获得了无 100K 结合的 “成熟” hexon 结构。
- 100K-hexon 复合物的整体结构：100K-hexon 复合物形似 “短火箭”，由三个 hexon 原聚体和三个 100K 二聚体组成。100K 二聚体对称地环绕在 hexon 的双果冻卷底部，与相邻 hexon 原聚体形成直接且不对称的相互作用，存在 A、B、C 三个接触位点。
- 100K 的结构：100K 分子形成对称二聚体，呈 “X” 形结构，主要由 α- 螺旋和环组成。其结构可大致分为钩状结构域（residues 555 - 695）和二聚化结构域（residues 159 - 554），二聚化结构域介导 100K 二聚体的形成，钩状结构域则与 hexon 相互作用。
- 未成熟 hexon 的结构：研究获得了与 100K 结合和未结合的两种 hexon 构象。与 100K 结合的 hexon 处于 “未成熟” 状态，其底部双果冻卷结构域相较于 “成熟” hexon 更为松散，部分介导成熟 hexon 中果冻卷结构域相互作用的疏水环以及连接 β 片层处于无序状态。
- 100K 与 hexon 在接触位点 A、B、C 的相互作用：在接触位点 A，100K 的钩状结构域插入两个未成熟 hexon 原聚体之间，其 α20 螺旋和 678 - 695 环与 hexon 的疏水口袋相互作用；接触位点 B 处，100K 二聚化结构域的 285 - 310 环与 hexon 原聚体的 C 末端果冻卷桶相互作用；接触位点 C 涉及 100K 二聚体化界面的疏水凹槽与 hexon 原聚体 N 末端片段（residues 48 - 60）的结合。
- 接触位点 A、B、C 相互作用的功能验证：通过对 100K 和 hexon 中参与相互作用的残基进行定点突变，利用尺寸排阻色谱（SEC）分析发现，破坏接触位点 A、B、C 的相互作用会显著影响 hexon 的正确折叠和组装，表明这些相互作用对于 100K 的分子伴侣功能不可或缺。此外，研究还发现 100K 的 N 末端区域虽影响其表达水平，但并非其分子伴侣功能所必需 。
- 100K 二聚体形式对其分子伴侣功能的重要性：研究证实 100K 在溶液中主要以二聚体形式存在，通过对 100K 二聚化界面的残基进行定点突变，发现破坏二聚体结构会导致 hexon 成熟三聚体的形成受阻，从而确认 100K 的二聚体形式对其分子伴侣功能至关重要。
研究结论与讨论
综合上述研究结果，研究人员提出了 100K 辅助 hexon 三聚化的模型。在细胞质中，100K 以二聚体形式预先存在，在 hexon 多肽链核糖体合成过程中，100K 二聚体迅速与新合成的 hexon N 末端结合，并结合 hexon 单体的疏水区以防止聚集。两个 hexon 单体通过一个 100K 二聚体间接相连，最终促成三个 hexon 原聚体的三聚化，在此过程中 hexon 的顶部插入环折叠成正确结构并进一步三聚化。
该研究意义重大，它首次揭示了 100K 与未成熟 hexon 三聚体的复合物结构，明确了 100K 在 hexon 折叠和组装过程中的关键作用机制。不同腺病毒中 100K 与 hexon 结合位点的保守性，暗示了它们可能在进化过程中存在共演化关系，这为后续研究提供了新的方向。此外，100K 具有多种功能，其结构中的无序区域在结合靶蛋白或配体时可能会变得有序，从而采用不同构象执行不同功能，这也为深入理解 100K 的功能多样性奠定了基础。同时，研究中发现的 hexon - 100K 复合物在细胞质中的稳定存在以及 hexon 转运到细胞核可能作为确保 hexon 三聚化和 100K 释放的检查点等现象，都为全面理解腺病毒的生命周期提供了重要依据，有望推动针对腺病毒感染的抗病毒药物研发和治疗策略的创新。
