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为解决蛋白质和 RNA 治疗药物细胞内递送难题，研究人员开展了工程化细胞外囊泡（EVs）的研究。他们构建了 VEDIC 和 VFIC 系统，实现高效细胞内蛋白递送及基因编辑，还可治疗 LPS 诱导的炎症，为疾病治疗提供新策略。
在生命科学和医学领域，蛋白质和 RNA 治疗药物具有独特的疾病治疗潜力，然而其细胞内递送却困难重重。细胞膜天生的不可渗透性，使得众多传统递送策略纷纷碰壁。像 iTOP 系统，虽能在体外实现蛋白质向原代细胞的高效递送，但在体内却 “有心无力”；细胞穿透肽（CPPs）在某些应用中初露锋芒，却因内体截留和潜在毒性问题而受限；各类纳米载体，如脂质纳米颗粒和聚合物，同样存在与 CPPs 类似的弊端，且合成性质可能引发体内副作用 。
在此背景下，来自瑞典卡罗林斯卡学院（Karolinska Institutet）等多个研究机构的科研人员开启了探索之旅，致力于找到突破细胞内递送困境的有效方法。他们将目光聚焦于细胞外囊泡（EVs），这是一种由脂质双分子层包裹的颗粒，能在细胞间传递生物活性分子，有望成为理想的递送载体。不过，利用 EVs 实现蛋白质的高效细胞内递送面临两大挑战：一是如何在 EVs 内部富集可溶且有活性的治疗性蛋白质；二是怎样让治疗性蛋白质从内体高效逃逸进入靶细胞胞质。
为攻克这些难题，研究人员精心设计并构建了两种创新系统 ——VEDIC（VSV-G plus EV-Sorting Domain-Intein-Cargo）系统和 VFIC（VSV-G-Foldon-Intein-Cre）系统。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为蛋白质和 RNA 治疗药物的细胞内递送带来了新曙光。
研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞模型构建方面，利用多种报告细胞系（如 Traffic Light（TL）荧光 Cre 报告细胞、CRISPR 报告细胞等）来评估 EVs 的递送效率。在 EVs 的制备与纯化上，通过转染相关质粒，借助瞬时转染技术使 HEK293T 细胞产生 EVs，随后采用切向流过滤（TFF）、尺寸排阻色谱（SEC）和密度梯度超速离心（DGUC）等方法进行分离纯化 。此外，运用多种检测技术，如流式细胞术、共聚焦显微镜、蛋白质免疫印迹（Western blot）分析等，对 EVs 的功能、蛋白质表达水平及细胞内定位等进行全面检测。
开发 VEDIC 系统实现高效细胞内蛋白质递送
研究人员借助 Traffic Light（TL）荧光 Cre 报告细胞评估 EVs 递送功能蛋白的潜力。实验发现，单独的 Cre、CD63 - Cre、CD63 - Intein - Cre 或 Intein - Cre 过表达细胞产生的 EVs 均无法诱导报告细胞发生重组。经筛选 40 种人类和病毒来源的融合蛋白后，发现病毒融合蛋白 VSV - G 与 CD63 - Intein - Cre 共转染可显著提升 Cre 递送效率，由此构建了 VEDIC 系统。该系统在多种细胞系中呈现剂量依赖性重组，在难转染细胞系中也能实现有效重组，且经 SEC 纯化后仍能保持活性，与已发表的 Nanoblade VLP 系统相比，在部分细胞系中表现更优 。在共培养实验中，无论是直接共培养、IBIDI 共培养还是 Transwell 实验，VEDIC 系统均能使受体细胞发生显著重组。
开发 VFIC 系统进一步提升细胞内蛋白质递送效率
为优化 VEDIC 系统，研究人员尝试将关键组件整合到单个构建体中。实验表明，VSV - G 可作为有效的 EV 加载蛋白，基于此构建了 VSV - G - Intein - Cre 和 VSV - G - Foldon - Intein - Cre（VFIC）融合蛋白。实验显示，VFIC 系统在报告细胞中呈现剂量依赖性重组，在低剂量实验中表现更优，且在难转染细胞中也能有效介导重组。经 SEC 或 DGUC 纯化后，VFIC EVs 仍保持高效的 Cre 递送能力，在共培养实验中同样能使受体细胞发生显著重组。
pH 敏感型内含肽在 EV 生物发生过程中进行 C 末端切割
研究人员为验证所用内含肽在 pH 依赖方式下进行 C 末端切割，引入了 H439Q 和 N440A 两个突变体。Western blot 结果显示，突变体的切割率与预期相符，功能实验表明，含突变体的 VEDIC 和 VFIC 系统在报告细胞中的重组率显著降低，证实了内含肽在 EV 生物发生过程中能以 pH 依赖方式进行 C 末端切割，形成可溶性货物蛋白。
VSV - G 促进受体细胞内受体介导的内吞后内体逃逸
为明确 VSV - G 在内体逃逸和内吞作用中的角色，研究人员引入了破坏融合（P127D）或 LDL - R 受体结合能力（K47Q）的突变体。通过共聚焦显微镜观察发现，VSV - G 能促进货物从内体逃逸进入胞质，而突变体则导致货物在内体截留。蛋白质免疫印迹分析和重组实验表明，突变体的 Cre 递送效率和重组活性显著降低，进一步证实了 VSV - G 在促进内体逃逸中的关键作用。
利用 VEDIC 和 VFIC 系统实现 Cas9/sgRNA RNPs 和靶向 PCSK9 的大范围核酸酶的稳健基因编辑
研究人员将 Cas9 封装到工程化 EVs 中，以 CRISPR 报告细胞评估 Cas9 - RNP 的递送效果。实验观察到，VEDIC 和 VFIC EVs 处理的细胞呈现剂量和时间依赖性的基因编辑，VFIC EVs 的基因编辑效率高达近 80% 。对小鼠转甲状腺素蛋白（mTTR）基因的靶向编辑显示，N2a 细胞经工程化 EVs 处理后，indels 率达 80%。此外，构建的靶向 PCSK9 的 VEDIC 和 VFIC 构建体，能使细胞中 PCSK9 蛋白水平显著降低。
VEDIC 和 VFIC 系统在体内的应用
在体内实验中，研究人员对携带 B16F10 - TL 黑色素瘤异种移植物的小鼠进行瘤内注射，以及对 R26 - LSL - tdTomato 报告小鼠进行脑室内（ICV）注射，均检测到显著的 Cre 介导的重组。利用渗透泵进行 ICV 注射，可使海马体和皮层中分别有高达 40% 和 30% 的细胞被编辑。经腹腔注射后，在肝脏和脾脏中观察到大量 tdTomato 阳性细胞，且在脾脏中发现功能性递送主要发生在白细胞（CD45+），尤其是 T 细胞（CD3+）和巨噬细胞（F4/80+）中 。
治疗脂多糖（LPS）诱导的全身炎症
研究人员运用 VEDIC 和 VFIC EVs 递送 NF - κB 活性超级抑制剂（SR），治疗 LPS 诱导的全身炎症。体外实验表明，SR 能成功抑制 TNF - α 介导的 NF - κB 信号激活。体内实验显示，经 VEDIC 和 VFIC EVs 治疗的小鼠，体重减轻和死亡率显著改善，肝脏、肾脏和肺部的炎症细胞浸润减少，证明了该系统在疾病治疗中的有效性。
研究人员通过开发 VEDIC 和 VFIC 系统，成功突破了 EV 介导的蛋白质治疗药物递送的关键瓶颈，实现了功能蛋白在体外和体内的高效细胞内递送，为治疗多种疾病带来了新希望。这一研究成果不仅在基因编辑领域展现出巨大潜力，有望用于治疗中枢神经系统（CNS）遗传疾病等；还在炎症性疾病治疗方面取得进展，为相关疾病的治疗提供了新的策略和方法，推动了生命科学和健康医学领域的发展。
