人Fc融合蛋白细胞系开发：Sphere Bio赋能临床应用新前景

人Fc融合蛋白与微流控技术

人Fc融合蛋白是通过基因工程技术将免疫球蛋白（如IgG）的Fc段与具有特定生物学功能的蛋白或多肽融合而成的重组蛋白。其核心设计在于利用Fc段的特性（如延长半衰期、增强稳定性、介导效应功能）优化功能蛋白的药代动力学和药效学特性。例如，类风湿性关节炎的经典药物Etanercept（TNF-α受体-Fc融合蛋白），即通过Fc段与FcRn受体结合，将半衰期从天然TNF-α受体的数小时延长至约72小时。目前人Fc融合蛋白已成熟运用在自身免疫性疾病、血友病治疗和眼科疾病的临床治疗上，在肿瘤免疫治疗、基因治疗载体等新兴领域也具有巨大的发展潜力。

Sphere Bio的Cyto-Mine®及Cyto-Mine® Chroma系统提供了细胞系开发的新思路，基于微流控芯片和皮升液滴技术可在1天内完成传统技术2-3周的单细胞筛选工作，显著缩短了开发周期并提升了产品质量，具备高通量、自动化、单克隆源性保证的特性。

Cyto-Cellect® Fc Fusion试剂盒：快速检测，精准结果

Sphere Bio最新推出的Cyto Cellect®Fc融合检测试剂盒旨在与Cyto-Mine®Chroma单细胞分析平台协同工作，检测由包裹在皮滴内的细胞分泌的具有人Fc区的Fc融合蛋白。皮滴内细胞分泌的Fc融合分子破坏了预先形成的FRET（Förster共振能量转移）探针的相互作用，导致FRET信号降低（图1）。Cyto Mine®及检测试剂盒可以通过检测分泌的Fc融合分子来测定单细胞的生产能力，从而鉴定和选择生产力最高的细胞。

图1. Cyto Cellect®Fc融合检测试剂盒示意图。

性能表现及实测数据

在这里，我们证明了Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒检测含有人IgG Fc结构域的Fc融合蛋白的适用性。并证明该试剂盒不仅可用于Cyto-Mine®，成功分离人Fc融合蛋白以及分泌IgG4κ的细胞，还可用于微孔板读板机，可靠地检测人Fc融合蛋白以及人IgG1-4。

方法  

1使用Cyto-Cellect®Fc融合试验在微孔板读板机中检测Fc融合蛋白及人IgG1-4抗体

1.1.1在Cyto-Cellect®Fc融合FRET探针存在的情况下，对市售的含有人IgG1 Fc结构域的Fc融合蛋白（Abatacept、Abatacept (Fc沉默)：CTLA-4 Fc融合；Etanercept：TNF受体2 Fc融合）进行滴定（150 nM–2.34 nM，2倍稀释，6点滴定）。

1.1.2在Cyto-Cellect®Fc融合FRET探针存在的情况下，对市售的人IgG1-4κ或λ抗体进行滴定（133 nM–2.1 nM，2倍稀释，6点滴定）并孵育2小时。

1.2在微孔板读板机中测定FRET信号：激发波长488nm，发射波长520nm（绿色通道）和620nm（红色通道）。

注：通过将红色通道强度除以绿色通道强度来计算FRET信号，并基于0nM Fc融合蛋白（对照）的信号值进行FRET信号的均一化。

2使用Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒检测和分配Cyto-Mine®中的CHO细胞

将分泌Fc融合蛋白（1.1x105个细胞/mL）或人IgG4κ（3.4 x105个细胞/mL）的CHO细胞重悬在包裹培养基（83%生长培养基、16%Opti-prep、1% Poloxamer 188）和Cyto-Cellect®Fc融合FRET探针中，然后装载到Cyto-Cartridge上，使用Cyto-Mine®检测分泌物。

Cyto-Mine®是基于微流体技术的单细胞筛选、分选、分配和验证的集成化平台——包裹：细胞和FRET探针被包裹在皮滴中；孵育：在37℃的孵育室内孵育，以获得靶蛋白分泌的最佳条件；检测：分泌的靶蛋白在皮滴内积累，被FRET探针捕获和检测；分选：Cyto-Mine®检测分泌特定蛋白质的细胞并分配到孔板中（如图2所示）。

图2. Cyto-Mine®工作流程，是基于微流体技术的单细胞筛选、分选、分配和验证平台。

实测数据  

Cyto-Cellect®Fc融合探针以浓度依赖的方式检测人Fc融合蛋白及人IgG1-4

通过基于微孔板读板机的FRET信号测定验证Cyto-Cellect®Fc融合探针检测人Fc融合蛋白的表现，数据显示Abatacept和Etanercept浓度的增加会导致FRET反应的降低，这与这些分子从受体探针中置换FRET供体是一致的。重要的是，Abatacept中的Fc沉默突变不会影响FRET反应（图3A）。将Abatacept作为靶分子，观察随时间变化的FRET反应，发现30分钟的短期孵育足以诱导50%的变化（图3B）。

图3. 基于微孔板读板机测定Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒检测人Fc融合蛋白的表现。

Cyto-Cellect®Fc融合探针以浓度依赖的方式检测人IgG1-4

由于所测试的市售Fc融合蛋白含有人IgG1 Fc结构域，因此使用市售人IgG1-4抗体测试了Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒检测其他IgG Fc结构域的能力。Cyto-Cellect®Fc融合探针对商业IgG1-4κ（图4左）和IgG14λ（图4右）显示出剂量依赖性反应，与Abatacept相比，EC50值更高，表明Fc融合蛋白可以比母体IgG分子更有效地与供体探针竞争。有趣的是，还观察到对人类IgGκ和λ分子的反应存在差异，尤其是在IgG1、3和4κ的情况下，反应稳定在约66 nM。对于相应的IgGλ亚类，没有观察到这一点。

图4. 基于微孔板读板机测定Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒检测人IgG1-4的表现。

使用Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒在Cyto-Mine®中筛选分泌Fc融合蛋白的CHO细胞

细胞孵育1 h后，分泌Fc融合蛋白的CHO细胞的FRET信号减弱（图5A，孵育1h）。继续增加细胞孵育时间可以提高门控群体的检测率（图5B，孵育2h）。随后将分选的皮滴分配到微孔板中，并监测细胞生长2周。数据显示，分配的细胞仍然存活并生长成菌落。随后对>600个菌落进行筛选，结果显示89.8%的克隆分泌所需的Fc融合蛋白。

图5. Cyto-Mine®+Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒用于富集和分配分泌Fc融合的CHO细胞。

使用Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒在Cyto-Mine®中筛选分泌人IgG4κ抗体的CHO细胞

经过1h和2h的孵育后，Cyto-Mine®检测到的分泌人IgG4的CHO细胞的FRET信号如图6所示。当孵育1h时，使用Fc融合探针能在Cyto-Mine®检测到分泌人IgG4的细胞（图6A）。虽然更长的潜伏期增加了信号强度，但门控群的百分比保持不变（图6B）。

图6. 使用Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒在Cyto-Mine®中检测分泌人IgG4κ抗体的CHO细胞的表现

结论

数据显示，Sphere Bio提供的Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒对分泌的Fc融合蛋白提供灵敏的FRET反应，并与微孔板读板机和Cyto-Mine®兼容。

1 兼容性

Cyto-Cellect® Mouse试剂盒与微孔板读板机和Cyto-Mine®兼容。

在微孔板读板机中使用Cyto-Cellect®Fc融合探针可检测到人IgG 1-4（κ和λ）以及Fc沉默的Abatacept。

在Cyto-Mine®中，该试剂盒能够在单细胞水平下自动化完成富集、分选和分配分泌Fc融合分子和人IgG（IgG4κ测试）的CHO细胞。其处理非常温和，很大程度保证了分配细胞的活性，可在下游培养中成功增殖和生长。

2 Fc融合蛋白的检测灵敏度

该试剂盒可灵敏检测所有四个IgG亚类的Fc结构域，以及Fc沉默突变Fc结构域。

3 高信号强度和灵敏度

该试剂盒在微孔板读板机和Cyto-Mine®检测中均显示出良好的信号强度，FRET信号增加了4倍以上。

4 无动物源性（AOF）

Cyto-Cellect®Fc融合试剂盒是AOF，可以与Cyto-Mine®一起用作治疗性细胞系开发（CLD）工作流程的一部分。

Sphere Bio提供的Cyto-Mine®及Cyto-Mine® Chroma是集微滴生成、微滴孵育、信号检测、微滴分选和单细胞分配为一体的高度自动化平台，旨在利用微流控技术在大量细胞样品中发现罕见和有价值的细胞，有效加快抗体发现和细胞系开发的流程。用户可根据需要自由选择单根激光器或4根激光器的配置，以满足多样化的应用需求。

图7. Cyto-Mine®

关于我们

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