预染Marker条带异常续集：那些容易被忽视的隐藏雷区

在上一篇文章中，我们分析了预染蛋白Marker实验中常见的条带弥散、条带缺失、小分子不显、转膜失败等五大问题，也给出了对应的解决方案。本次，我们将继续就上次遗留的几个问题进行分析和解答，让您从此告别“玄学”困惑，得出科学实验结果！

一、条带“变形记”——上下宽窄不一

现象：Marker条带像被“压缩”或“拉长”，垂直方向宽窄不均

幕后黑手：

电泳“发烧”：电压过高（>150 V）导致凝胶局部过热，条带迁移速率异常（高温区扩散变宽，低温区压缩变窄）。

加样孔超载：上样量>10 μL时，蛋白质溢出孔外，迁移初期横向扩散，后期压缩形成“上宽下窄”。

急救指南：

恒压电泳（100-120 V）+ 冰浴降温；

控制上样量（5-8 μL），选用平整制胶梳子

二、标签蛋白检测的“真假信号”

灵魂拷问：Marker会干扰我的目标蛋白检测吗？

事实真相：

1. 常规情况：Marker与样品分属不同泳道时，几乎无干扰（抗体检测 vs 染料显色原理不同）

2. 高危场景：

• 同泳道混合上样：Marker高浓度蛋白改变局部电场，导致目标条带迁移偏移；

• Marker含同源标签：如His标签Marker遇His抗体，引发假阳性；

• 转膜残留：预染染料转移到膜上，与荧光检测信号重叠。

避坑方案：Marker和样品泳道分开，看清Marker是否含有同源标签，优化转膜条件，每次实验必做对照。

三、理论值VS实际值：谁在“偷改”分子量？

真相：预染Marker标注的是“表观分子量”，与理论值偏差±5%-10%是常态，这是由其染料修饰特性决定的，并非质量问题！

偏差来源：

1. 染料修饰：共价结合的染料改变蛋白质电荷和构象（如35 kDa条带可能对应33 kDa蛋白）；

不同分子量蛋白的偏移程度不同：

• 小分子量蛋白（<30 kDa）因染料占比相对较高，偏移更明显；

• 大分子量蛋白（>100 kDa）偏移相对较小。

2. 电泳体系差异：Tris-Glycine胶与Bis-Tris胶中同一蛋白迁移率不同。

以基因自营蛋白Marker（货号：PM-S001）为例

破局之道：

严格按说明书条件跑胶；

用未预染Marker或已知蛋白校准；

查UniProt数据库对比“表观分子量”。

四、非变性胶：“标尺”失效的魔幻世界

致命误区：把预染Marker直接用于Native PAGE！

翻车现场：

1. 标注值全错：非变性胶中蛋白质迁移由电荷和形状决定，预染Marker的分子量标注（基于SDS线性化）完全失效；

• 依赖SDS的线性化作用 预染Marker的蛋白质经过SDS和还原剂（如β-巯基乙醇）处理，变为线性结构并携带均匀的负电荷，其迁移速率在变性胶中仅由分子量决定。

• 非变性胶中无SDS 蛋白质保持天然构象，迁移速率受分子量、电荷、形状及多聚体状态共同影响，预染Marker的分子量标注不再适用。

2. 条带“集体摆烂”：染料干扰天然构象，导致迁移异常、拖尾严重。

预染Marker的染料（如考马斯亮蓝、荧光染料）共价偶联在蛋白质表面，可能改变蛋白质的天然电荷分布、破坏蛋白质的寡聚结构（如二聚体、四聚体）、导致迁移行为异常，无法反映真实分子量或生理状态。

救星方案：

Native PAGE使用非变性胶专用Marker；

自制天然蛋白标准或选已知天然分子量和寡聚状态的蛋白质，单独跑胶并记录迁移位置，建立校准曲线。

五、其他“隐匿神坑”

储存不当引发的“慢性自杀”：大分子量条带降解消失，-80℃分装保存是王道！

 现象：大分子量条带变弱或消失，小分子量条带出现额外杂带（降解产物）。  

 原因：预染Marker含多种蛋白，反复冻融（尤其-20℃保存时）会加速蛋白断裂。  

 避坑：分装成单次用量（如5 μL/管），-80℃长期保存，使用前短暂离心。

批次差异的“玄学暴击”：新旧批次迁移率漂移3-5 kDa，关键实验勿换批次！

 现象：同一品牌Marker，新批次条带位置与旧批次相差3-5 kDa。  

 原因：生产过程中染料偶联效率或蛋白批次差异。  

 避坑：关键实验全程使用同一批次Marker。新旧批次同时跑胶对比，建立校正系数（如新批次35 kDa≈旧批次33 kDa）

缓冲液重复使用导致的“盐失衡”：发现异常，及时更换！

 现象：条带扭曲呈波浪形，分子量越大的条带偏移越明显。  

 原因：缓冲液反复使用后离子强度下降，电场分布不均。  

 避坑：每次电泳更换新鲜缓冲液，若需节约可单独回收负极缓冲液（Tris-Glycine体系）。

未离心的“沉淀炸弹”：聚集体导致拖尾，使用前务必瞬时离心！

 现象：条带拖尾或出现不规则沉淀带。  

 原因：长期静置后Marker中部分蛋白或染料形成聚集体。  

 避坑：使用前瞬时离心（12,000 rpm，30秒），吸取中间澄清液体。

六、终极避坑指南

对照三原则：Marker每次必跑，换批次必对比，异常必重复！

保存口诀：“分装、避光、勿反复冻融，离心、控量、低温存”

异常排查路线图：

条带异常 → 查储存/批次 → 换新胶/缓冲液 → 调电泳参数 → 验证转膜条件 → 交叉对比抗体！

预染蛋白Marker是实验的“沉默助手”，却也可能化身“隐形刺客”。唯有摸清它的脾性，规范每一个细节，才能让Western Blot不再上演“悬疑剧”！你在实验中还遇到过哪些Marker“神坑”？欢迎留言区吐槽！（小编将在下期持续为大家解惑）

欲了解更多产品详情，请扫码添加您的专属技术顾问，基因有限公司将以热忱与专业，为您提供最优质的服务！