基于MMI激光显微切割+Covaris聚焦超声的脑胶质瘤空间蛋白组研究

研究背景

胶质母细胞瘤是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，其特征包括肿瘤内的异质性以及对周围脑组织的广泛侵袭。胶质母细胞瘤已知会重塑大脑的细胞外基质（ECM），从而改变其机械特性，并建立促进肿瘤发展的微环境。但胶质母细胞瘤内细胞外基质成分表达和空间分布的变化如何促进肿瘤侵袭和疾病进展，目前仍不清楚。

为此，英国曼彻斯特大学研究人员利用MMI激光显微切割与质谱联用（LCM-MS）的空间蛋白组方法，对FFPE人脑胶质母细胞瘤样本进行ECM的空间蛋白组分析，并鉴定出53种ECM蛋白，与快速冷冻组织样本的分析结果相当，并且分析结果显示出肿瘤核心与浸润边缘的基质成分存在明显差异。该研究“Novel Laser Capture Microdissection-Proteomic Analysis Identifies Spatially Distinct Extracellular Matrix Signatures in the Core and Infiltrating Edge of Human Glioblastoma”于2022年9月发表在BioRxiv预印本上。

研究方法

如下图所示，将胶质母细胞瘤FFPE样本制成5µm切片，利用MMI CellCut激光显微切割系统从多个切片中解离出相同体积（0.05mm3）的肿瘤核心区域和浸润边缘区域，进行质谱分析；同时制备快速冷冻组织的胶质母细胞瘤样本进行质谱蛋白组学分析。其中，FFPE样本及快速冷冻组织的蛋白提取过程均借助Covaris LE220-Plus进行10min超声处理。

研究结果

结果一 LCM-MS能够对FFPE胶质母细胞瘤组织进行空间蛋白组分析

通过对胶质母细胞瘤的快速冷冻组织和LCM FFPE样本进行蛋白组学分析发现，在速冻组织中共鉴定出2007种蛋白质，而在LCM样本中鉴定出1384种蛋白质，其中边缘和核心样本分别鉴定出1218种和808种蛋白质；细胞外基质蛋白在速冻组织中鉴定出69种，LCM样本中鉴定到53种（边缘和核心均39种）；在速冻组织中鉴定到的细胞外基质蛋白约有一半也在LCM样本中被鉴定出来；速冻组织和LCM样本中每个基质组分亚类的蛋白质比例相当（如图1所示）。由此可见，LCM-MS方法能够逆转FFPE脑组织切片中的交联作用，从而实现空间分辨的蛋白组学分析。

图1. 对快速冷冻组织及FFPE胶质母细胞瘤样本进行蛋白组学分析比较。

另外，为评估LCM FFPE样本空间蛋白组学的可重复性，本研究从单个样本的连续切片中，分别对肿瘤核心和边缘区域进行三次重复分析。结果显示，LCM-MS分析FFPE脑组织具有可重复性，且肿瘤核心区域微环境的异质性大于浸润边缘的异质性（如图2所示）。

图2. LCM-MS分析FFPE脑组织具有可重复性。

结果二 LCM-MS鉴定胶质母细胞瘤核心和浸润边缘的微环境差异

在证实了激光显微切割的空间蛋白组学能够用于研究FFPE胶质母细胞瘤组织的全局和ECM特异性蛋白组特征后，本研究从三个独立的肿瘤样本中分别激光显微切割出核心区域和边缘区域进行质谱分析，共鉴定出1107种蛋白质，其中79种蛋白在核心和边缘区域存在显著差异；另外，对差异蛋白丰度数据进行了通路分析，发现与边缘区域相比，细胞周期、DNA复制、基因表达、RNA代谢和蛋白质代谢等与细胞增殖相关的通路在肿瘤核心区域更为丰富，更加印证了肿瘤核心区域是快速增殖癌细胞的聚集地。

图3. 对脑肿瘤组织核心和浸润边缘区域蛋白进行定量分析比较。

为探究肿瘤核心和浸润边缘是否各自具有独特的ECM成分，本研究分别对肿瘤核心和边缘的质谱数据进行独立处理分析。结果发现，在核心和边缘分别鉴定出43种和21种ECM蛋白，其中有24种基质蛋白仅存在于核心区域，3种仅存在于浸润边缘；还有19种基质蛋白在两个区域均有发现，但其相对丰度存在差异；与浸润边缘组织相比，基质组分（包括细胞外基质糖蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖）在肿瘤核心区域更为丰富，浸润边缘主要由基质相关蛋白组成。这些结果与临床观察一致，表明在疾病进展过程中，肿瘤核心微环境的细胞外基质密度逐渐增加，机械硬度逐渐增强。

图4. 肿瘤核心和浸润边缘区域ECM蛋白分析比较。

此外，本研究通过免疫组化方法独立验证特定的细胞外基质特征，由于纤维连接蛋白和腱生蛋白R分别仅在核心区域和浸润边缘区域被质谱鉴定到，因此选择这两种蛋白进行验证。这些发现共同证实了LCM-MS空间蛋白组的结果，也进一步表明该方法能够对胶质母细胞瘤区域的细胞外基质微环境进行空间分辨的蛋白组分析。

结论

基于MMI激光显微切割系统的LCM-MS蛋白组学方法能够对胶质母细胞瘤FFPE组织中的细胞外基质进行准确的空间分辨分析，其性能与快速冷冻组织的分析结果相一致。不仅如此，该方法也同样适用于更广泛的空间蛋白质组学研究，是研究肿瘤/组织异质性的重要工具。该方法的建立具有获取临床病史和随访信息的优势，为回顾性研究提供了可能，也为胶质母细胞瘤的转化研究提供了宝贵的资源。

MMI激光显微切割方法流程：

基于Covaris的FFPE蛋白提取流程：

基于Covaris的快速冷冻组织蛋白提取流程：

基于MMI激光显微切割的空间多组学方案

德国Molecular Machine & Industries (MMI)是专门致力于将显微操作技术与高精度激光技术相结合应用于生命科学领域的一家专业公司，其标志性产品MMI CellCut激光显微切割系统和CellEctor单细胞分选系统成为目前世界上性能优异的样本处理系统。基因有限公司作为MMI产品中国区合作伙伴，可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑及联系试用等。

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