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在药物研发中，“3D” 分子优势凸显，含氮杂环及手性化合物意义重大。研究人员筛选 11 种野生型酵母菌株和面包酵母，对 N-(3 - 氧丁基) 杂环化合物进行生物还原研究。结果显示，近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）表现最佳，还实现了其全细胞固定化与回收利用。该研究为药物研发提供了新方法。
在药物研发的奇妙世界里，分子结构就像一把神奇的钥匙，决定着药物能否精准地开启治疗疾病的大门。过去，大多数活性药物成分（APIs）是富含
sp2的刚性分子，然而近年来的研究发现，“3D” 分子，也就是那些主要由
sp3原子构成的分子，在药物研发的各个阶段，从最初的发现到最终成为注册药物，都展现出了更大的潜力。
分子的形状和大小在分子描述符的层级体系中处于首要地位，分子形状的多样性是分子库具有广泛生物活性的前提条件。基于片段的药物发现（FBDD），就像是在化学空间中寻找宝藏的神奇工具，它利用各种化学支架和功能来覆盖广阔的化学空间，帮助研究人员识别新的化学先导物。
在众多药物中，含氮杂环化合物十分常见。研究表明，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的小分子 API 中，84% 含有至少一个氮原子，59% 包含氮杂环。哌嗪就是第三常见的氮杂环，在阿立哌唑、氯氮平、西替利嗪等药物中都能找到它的身影。此外，手性化合物作为 API 合成的重要中间体和基石，其对映体纯度至关重要。许多手性药物中都含有不对称的仲羟基，比如降血脂药物依泽替米贝、β 受体阻滞剂卡维地洛、5 - 羟色胺 - 去甲肾上腺素再摄取抑制剂度洛西汀等。
然而，目前利用酮还原酶（KREDs，也称为醇脱氢酶，ADHs）在工业规模合成手性醇的过程中，面临着一些挑战。为了让 KRED 催化的过程可行，需要一个高效的辅酶再生系统来循环利用昂贵的辅酶。虽然已经有多种辅酶再生系统被报道，但利用全细胞系统中的 KRED 和廉价易处理的异丙醇作为共底物的方法，虽然具有易于扩展和适用于 NADH 和 NADPH 依赖型酶的优点，但也存在需要从反应混合物中去除生成的丙酮以推动平衡的问题。
在这样的背景下，来自布达佩斯技术与经济大学（Budapest University of Technology and Economics）等机构的研究人员，踏上了探索之旅。他们开展了一项关于利用野生型酵母菌株和市售面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）的全细胞形式，对具有（部分）饱和杂环部分的 N-(3 - 氧丁基) 杂环化合物进行生物还原的研究。该研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology 》上。
研究人员在实验过程中用到了多种关键技术方法。首先，他们通过核磁共振（NMR）、红外光谱（IR）、旋光仪等多种分析手段对反应产物进行结构和纯度表征。利用气相色谱（GC）来确定生物还原反应的转化率和对映体过量值。在筛选生物催化剂时，采用薄层层析（TLC）进行初步筛选，再用 GC 对有活性的反应进行深入分析。对于最佳表现菌株近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis），研究人员使用海藻酸钠包埋法将其固定化，并对固定化细胞进行了一系列的测试 。此外，还运用分子对接技术，探究底物在酶活性位点的结合模式。
下面来看看具体的研究结果：
- 初始筛选反应：研究人员对 11 种野生型酵母菌株和面包酵母进行筛选，以检测它们对目标底物 2a - e 的酮还原酶活性。通过 TLC 初步筛选，发现 5 种菌株（Pichia carsonii (WY1)、Lodderomyces elongisporus (WY2)、Candida norvegica (WY4)、Candida parapsilosis (WY12) 和 Rhodotorula glutinis (WY51)）具有可检测的活性。进一步的 GC 分析表明，近平滑假丝酵母（WY12）表现最为出色，对部分底物的转化率极高，能将前手性底物完全转化为对映纯的醇，且对映体过量值ee>99%。Pichia carsonii (WY1) 和 Lodderomyces elongisporus (WY2) 也表现出较好的活性，而面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）无论是湿态还是干态，对底物的转化率都较低，效果不理想12。
- 固定化酵母的生物还原反应：研究人员将表现最佳的近平滑假丝酵母（WY12）进行全细胞固定化，制备了钙、锌、镍、铜海藻酸盐珠固定化细胞。以 4-(3,4 - 二氢喹啉 - 1 (2H)- 基) 丁 - 2 - 酮（2a）和 4-(吲哚 - 1 - 基) 丁 - 2 - 酮（2b）等为底物进行反应，发现 Im - WY12 - Cu 几乎没有活性，Im - WY12 - Ni 活性适中，而 Im - WY12 - Ca 和 Im - WY12 - Zn 表现出较高的酮还原酶活性，在较短时间内就能达到较高的转化率。对其他底物如 4-(4 - 苄基哌嗪 - 1 - 基) 丁 - 2 - 酮（2d）和叔丁基 4-(3 - 氧丁基) 哌嗪 - 1 - 羧酸酯（2e）的反应中，固定化细胞也展现出了比游离细胞更高的转化率34。
- 固定化生物催化剂的可回收性：研究人员以 4-(吲哚 - 1 - 基) 丁 - 2 - 酮（2b）为底物，对 Im - WY12 - Ca 和 Im - WY12 - Zn 的可回收性进行了测试。结果显示，在 6 个反应循环中，Zn2+交联的 Im - WY12 - Zn 在前三个循环中转化率较高，但稳定性较差；Ca2+交联的 Im - WY12 - Ca 稳定性更好，在第 6 轮反应中仍能保持一定的活性，可转化 32% 的底物56。
- 酮 2a、b、d、e 的制备规模生物还原：研究人员对 4 种酮（2a、b、d、e）进行了制备规模的生物还原，以分离和表征对映纯的产物。分别使用冻干的近平滑假丝酵母（WY12）细胞和 Zn - 海藻酸盐包埋的 Im - WY12 - Zn 进行反应。结果表明，使用 Im - WY12 - Zn 进行反应，简化了后处理过程，减少了乳液形成，提高了产物的产率，且制备规模的生物还原反应转化率与小规模筛选反应相当，产物几乎都是对映纯的（ee>99%）78。
- 产物醇 (S)-1a - e 的绝对构型确定：研究人员通过两种独立的方法确定了产物醇 (S)-1a - e 的绝对构型。一是对 4-(3,4 - 二氢喹啉 - 1 (2H)- 基) 丁 - 2 - 醇进行动力学拆分，二是利用分子对接模拟底物在近平滑假丝酵母醇脱氢酶活性位点的排列，以及对酶促乙酰化过程中形成的四面体中间体进行比较计算。结果表明，所有制备的手性醇产物的绝对构型都是 (S) 构型910。
在讨论部分，研究人员指出，KRED 催化的具有柔性环的前手性 N-(3 - 氧丁基) 杂环化合物的生物还原是一个未被充分探索的领域。该研究扩展了天然酵母全细胞生物催化剂在涉及柔性 N - 杂环的酮类反应中的应用范围。全细胞固定化技术不仅使反应后处理更加简便，还提高了底物转化率，减少了副产物的生成，提升了产物的纯度和产率。此外，分子对接不仅确定了产物的绝对构型，还解释了不同底物反应活性差异的原因。
总的来说，这项研究为药物研发中手性 “3D” 杂环化合物的合成提供了新的方法和思路。通过筛选高效的酵母生物催化剂和优化反应条件，实现了对 N-(3 - 氧丁基) 杂环化合物的不对称生物还原，制备出了具有高对映体纯度的手性醇。这些手性醇作为有前景的手性片段，在药物研发中具有重要的应用价值。未来，研究人员还计划进一步拓展底物范围，尝试使用其他（部分）饱和杂环化合物进行反应，同时探索使用重组生物作为生物催化剂，以进一步优化生物还原反应，为药物研发开辟更广阔的道路。
