精准检测冷冻精液沙眼衣原体和淋病奈瑟菌：APTIMA Combo2?试剂盒的关键评估

在精子捐赠筛查中，冷冻精液里沙眼衣原体（CT）和淋病奈瑟菌（NG）的检测至关重要。研究人员评估 APTIMA Combo2?试剂盒在冷冻精液中检测 CT 和 NG 的性能。结果显示其检测限分别为 CT 102 IFU/mL、NG 10 CFU/mL，证实了该试剂盒的有效性。

　　在生殖医学领域，冷冻精液的合理利用与安全性评估是关键议题。沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）和淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）作为常见的性传播病原体，对生殖健康有着极大影响。CT 在全球范围内广泛传播，2020 年，15 - 49 岁人群中，女性患病率约 4.0%，男性约 2.5% 。它不仅是男性尿道炎的常见病因，还可能引发前列腺炎、附睾炎，甚至导致男性不育；在女性中，CT 感染可能无症状，也可能引发宫颈炎、尿道炎、盆腔炎，进而导致不孕和孕期并发症 。NG 同样不容小觑，全球 14 - 49 岁人群中约有 8240 万人感染 。男性感染 NG 后，90% 会出现症状，表现为急性尿道炎伴脓性分泌物；而女性感染后，不到一半的人会出现诸如阴道分泌物异常、下腹部不适和性交痛等症状。

在法国，医学辅助生殖（medically assisted reproduction，MAR）和配子捐赠的规范要求对精子捐赠者的新鲜尿液样本进行 CT 和 NG 的分子检测。然而，对于先前因生育保存而冷冻精液，之后又选择捐赠精液的情况，却缺乏相应的检测建议，此时只能对冷冻精液进行 “事后” 检测。核酸扩增检测（nucleic acid amplification test，NAAT）是 CT/NG 感染生物学诊断的金标准，但早期的 NAAT 在 PCR 抑制剂存在时，假阴性风险较高。Aptima combo²?检测（AC2）作为新一代 NAAT，采用了靶捕获、转录介导扩增（Transcription - Mediated Amplification，TMA?）和双动力学分析（Dual Kinetic Assay，DKA）技术，能够简化样本处理流程、扩增靶 rRNA 并检测扩增产物，从而提高检测灵敏度。不过，该试剂盒尚未在精液样本的 CT/NG 诊断中进行过测试和验证。此前，2019 年法国国家细菌性性传播感染参考中心对新鲜精液进行的研究虽显示该试剂盒对 CT、NG 等细菌检测限较低，但也发现新鲜精液对检测存在抑制作用，且未评估试剂盒在 CT - NG 共感染情况下的性能。基于这些问题，开展此项研究意义重大。

法国利摩日大学医院（CHU Limoges）等机构的研究人员进行了此次研究，旨在评估 AC2 试剂盒在冷冻精子样本中单独及共感染情况下检测 CT 和 NG 的检测限（limit of detection，LOD）。研究结果表明，在冷冻精子 / 甘油基质中，150μL 样本检测 CT 和 NG 的 LOD 分别为 10² IFU/mL 和 10 CFU/mL，共感染对 UTM（通用运输培养基）中的检测限有影响，但对精子 / 甘油基质无影响，同时发现精子 / 甘油基质相比对照 UTM 培养基存在抑制作用，不过共感染时未发现竞争效应。该研究成果发表在《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases》上，为冷冻精液筛查提供了重要依据，有助于保障精子捐赠的安全性，对生殖医学的发展意义非凡。

研究人员开展研究时用到的主要关键技术方法包括：使用核酸扩增检测（NAAT）技术，这是检测 CT 和 NG 感染的常用方法；采用 Aptima combo²?检测（AC2），其运用了靶捕获、转录介导扩增（TMA?）和双动力学分析（DKA）技术，可简化样本处理和提高检测灵敏度；以精子捐赠者的冷冻精液样本为研究对象，这些样本来自利摩日大学医院的生物样本库（CRBioLim），且经过了相关伦理审批。

实验材料和方法

1. 样本准备：实验使用精子捐赠者的冷冻精液样本，捐赠者需提供新鲜尿液样本，用 AC2 试剂盒检测 CT 和 NG，排除感染。精液样本按 0.7 v/v 比例在冷冻保护培养基（SpermFreeze?，Fertipro?）中稀释，该培养基含有多种成分，如甘油（15%）、蔗糖（浓度未公开）和人血清白蛋白（4.0 g/L）等。稀释后的样本冷冻保存于高安全性 straws 中，这些样本来自利摩日大学医院的生物样本库（CRBioLim，AC - 2021 - 4790，certified NF S96 - 900），经法国卫生部授权使用。
2. 菌株准备：选用 CT 参考菌株 D/UW - 3/cx（ATCC VR - 885?，由法国国家细菌性性传播感染参考中心提供）和 NG 临床分离株（保存于利摩日医院生物资源中心 CRBiolim），用 PBS 稀释至 1 - 10⁶ IFU 或 CFU/mL 浓度范围。
3. 实验步骤：首先，为确定获得足够灵敏度所需的最小测试体积，分别测试 50、100 和 150μL 样本体积，用不同浓度 CT 接种甘油稀释的精子或对照培养基（Thermo Scientific UTM?）。然后，在确定的最小体积下，分别用 CT、NG 或两者接种样本，测试其检测限。样本浓度若在三次独立测量中超过临界值则判定为阳性。不同测试样本转移至 Aptima multitest swab transport?，并使用 Aptima combo²?试剂盒在 PANTHER? 自动化系统上进行三次重复检测。最后，运用 Graphpad 软件计算平均值和标准差并进行统计分析。

实验结果

1. 确定最佳样本体积：在初步实验中，研究人员探究了样本基质的抑制作用，并确定了能维持两种 NAAT 检测灵敏度的最小样本体积。结果显示，150μL 样本在不同浓度测试点上，对每种感染病原体都能获得最佳灵敏度，尤其是在低浓度时效果显著。
2. 检测限结果：在冷冻精子 / 甘油基质中，150μL 样本检测 CT 和 NG 的 LOD 分别为 10² IFU/mL（单一感染和共感染）和 10 CFU/mL（单一感染和共感染）。共感染对 UTM 中的检测限有影响，但在精子 / 甘油基质中未发现这种影响。与对照 UTM 培养基相比，精子 / 甘油基质存在抑制作用，两种细菌的检测灵敏度各降低 1 log₁₀，不过共感染时这种差异不明显。

研究结论和讨论

本研究评估了 Aptima Combo²?试剂盒在冷冻精子基质中检测 CT 和 NG 的 LOD，发现单一感染和共感染情况下，CT 的 LOD 为 10² IFU/mL，NG 的 LOD 为 10 CFU/mL。这一结果与之前法国国家细菌性性传播感染参考中心对新鲜精液的研究结果一致，表明 15% 甘油冷冻保护培养基的 0.7 v/v 稀释对 Hologic AC2 检测的阈值似乎没有额外抑制作用，也证实了试剂盒说明书中关于 “阴道润滑剂” 无干扰的描述。同时，研究再次确认了精液对扩增的抑制作用，且共感染时未发现竞争效应，这在临床实践中意义重大，因为 CT 和 NG 共感染较为常见。

然而，该研究也存在一些局限性。一方面，这些检测限的临床相关性尚未确定。目前，关于临床感染患者精液中 CT 和 NG 细菌载量的研究较少，且不同研究方法和实验室条件下，IFUs 与 copies/mL 的对应关系存在差异，难以与本研究的 LOD 进行严格比较。另一方面，研究结果的可重复性也有待探讨。本研究使用的是精液参数正常的冷冻捐赠精子，而临床感染患者的精液可能因炎症反应出现白细胞增多、体积、pH 和粘度改变等情况，可能影响检测结果，且不同实验室的冷冻精液基质制备方法存在差异，也可能影响结果的一致性。

在配子捐赠的背景下，确定相关检测阈值以确保重定向精子吸管的安全性至关重要。使用含有足以感染受体的接种物的吸管，会对受体健康造成严重威胁，可能导致生殖系统感染，影响女性生育能力。虽然 CT 和 NG 对精子参数（活力、存活率和 DNA 碎片化）的直接影响在文献中存在争议，但它们与男性不育的关联备受关注。因此，使用受污染的吸管不仅危害受体健康，还可能降低辅助生殖治疗的成功率。在生育保存前，对尿液等经过验证的样本基质进行 CT 和 NG 的系统筛查，在获得患者知情同意的情况下，是一种有效的预防措施。

总体而言，本研究确定了 AC2 试剂盒检测 CT 和 NG 的有趣检测阈值，揭示了冷冻精子基质与新鲜精子基质抑制作用的差异。不过，仍需更多临床数据来确认这些 LOD 的相关性，以保障精子捐赠过程中不会将 CT 或 NG 传播给受体，为生殖医学的安全发展提供更坚实的保障。