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足菌肿是一种被忽视的热带病，现有诊断工具在流行地区应用受限。研究人员开发了基于等温的多重重组酶聚合酶扩增反应（RPA）。结果显示该方法能有效检测真菌 DNA 并区分病原菌，有望提升流行地区诊断能力，改善患者管理和治疗效果。
在热带和亚热带的乡村地区，有一种疾病正悄然影响着人们的健康，它就是足菌肿。足菌肿是一种慢性肉芽肿性感染疾病，主要侵袭皮下组织。得了这种病，患者的身体会出现肿瘤样肿块，还伴有窦道，会排出含有类似生物膜结构 “颗粒” 的脓性分泌物。如果病情发展到晚期还没得到治疗，患者可能会面临身体畸形、残疾，甚至失去生命。
足菌肿的病原体十分复杂，超过 90 种不同的病原体都可能引发这种疾病，其中包括细菌（放线菌性足菌肿）和真菌（真足菌肿）。在真足菌肿的众多病原体中，马杜拉足菌（Madurella mycetomatis）和塞内加尔镰刀菌（Falciformispora senegalensis）最为常见，分别占已报道病例的 85% 和 4% 。
目前，足菌肿的诊断面临着诸多挑战。传统的基于组织学和病原体培养的诊断方法，就像一场漫长的等待游戏，耗时极长，而且准确性也不尽如人意。而基于 PCR 的分子诊断方法虽然更为可靠，但需要对条形码基因进行测序或检测物种特异性遗传生物标志物，这些操作往往需要专业的设备和技术人员，在资源有限的流行地区，很难广泛应用。因此，开发一种既方便用户操作，又能适应现场检测环境的诊断工具，成为了医学领域亟待解决的问题。
为了攻克这一难题，来自荷兰伊拉斯姆斯大学医学中心（Erasmus MC）等机构的研究人员展开了深入研究。他们致力于开发一种基于等温的多重重组酶聚合酶扩增反应（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术，希望能将其融入流行地区的诊断流程中。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先，他们收集了 71 种真菌和 5 种细菌的分离株，这些菌株均来自足菌肿病原体。接着，从这些菌株中提取 DNA，为后续实验做准备。在实验过程中，他们设计了针对真菌内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）区域的 RPA 引物和探针，以此来检测真菌 DNA，并区分马杜拉足菌和塞内加尔镰刀菌。之后，通过对不同浓度的 DNA 进行扩增实验，测定了该方法的检测限 。
下面来看看具体的研究结果：
- 引物成功扩增不同真菌物种的 DNA：研究人员通过凝胶电泳对设计的 RPA 引物进行验证，结果显示，针对不同的真足菌肿病原体，均能成功扩增出相应的 DNA。以马杜拉足菌和塞内加尔镰刀菌为例，扩增出的片段大小分别为 407 碱基对和 376 碱基对 。
- RPA 探针可区分病原体：经过验证，马杜拉足菌特异性探针仅对马杜拉足菌产生阳性信号，塞内加尔镰刀菌特异性探针也只对塞内加尔镰刀菌有阳性反应，而 ITS 探针则对所有真菌分离株的 DNA 都能产生阳性信号，对放线菌性足菌肿病原体的 DNA 则无阳性信号 。
- RPA 检测限：在单重反应中，塞内加尔镰刀菌探针能可靠检测到 0.001ng（1pg）的真菌 DNA，马杜拉足菌和 ITS 探针能可靠检测到 0.01ng（10pg）的真菌 DNA；在多重反应中，检测限有所变化，塞内加尔镰刀菌探针能检测到 0.01ng（10pg）的真菌 DNA，马杜拉足菌和 ITS 探针能检测到 0.1ng（100pg）的真菌 DNA 。
- 成本分析：根据实验使用的试剂和仪器，研究人员计算出该多重 RPA 检测单个样本的试剂成本为 1.35 欧元。若使用罗氏 Lightcycler 480 进行检测，由于需要特定的 96 孔板，单个样本的总成本会升至 10.03 欧元；而如果采用其他读取系统，如 EasyStrip? Plus Tube Strip with Attached Ultra Clear Caps，单个样本的总成本则有可能降至 1.56 欧元 。
从研究结论和讨论部分可以看出，这项研究成果意义重大。研究人员开发的多重 RPA 检测方法，能够在 20 分钟内准确检测低至 0.01ng 的真菌 DNA，并且可以有效区分马杜拉足菌和塞内加尔镰刀菌。这一方法为真足菌肿的诊断带来了新的希望，尤其是在流行地区，有望显著提升诊断能力，从而为患者的管理和治疗提供更有力的支持，改善患者的治疗效果。虽然该方法还需要进行临床验证，但已经展现出了巨大的应用潜力，为足菌肿的诊断和治疗开辟了新的道路。
