基于结构的黄嘌呤-II型核糖开关配体识别机制解析及其生物传感器应用研究

本研究针对黄嘌呤代谢调控的关键科学问题，通过解析黄嘌呤-II型核糖开关（xanthine-II riboswitch）的三维结构，揭示了其区别于鸟嘌呤核糖开关的特异性配体识别机制。研究人员利用X射线晶体学（分辨率达2.1 ?）和等温滴定量热法（ITC），发现关键U-to-G突变和核苷酸插入形成独特的黄嘌呤结合口袋，并基于此开发出融合Pepper荧光适体的高灵敏度生物传感器。该成果发表于《Science China Life Sciences》，为黄嘌呤代谢紊乱疾病诊断提供了新工具，同时拓展了核糖开关工程化应用前景。

　　

在生命活动的精密调控网络中，核糖开关（riboswitch）作为RNA分子传感器，通过直接结合代谢物调控基因表达，成为近年来RNA结构生物学的研究热点。黄嘌呤（xanthine）作为嘌呤降解途径的关键中间体，其浓度异常与痛风、高尿酸血症等疾病密切相关。尽管已有两类黄嘌呤响应型核糖开关被发现，但黄嘌呤-II型核糖开关（xanthine-II riboswitch）如何从鸟嘌呤核糖开关家族演化出特异性识别能力，仍是未解之谜。

浙江大学医学院附属第二医院心血管研究所等机构的研究人员通过高分辨率结构解析和功能验证，首次揭示了xanthine-II riboswitch的分子识别密码。研究发现，该核糖开关通过独特的U37G突变和核苷酸插入，重构了结合口袋的氢键网络：黄嘌呤的3-NH与G37的N7形成关键氢键，而C64和U8分别通过沃森-克里克边（Watson-Crick edge）和糖边（sugar edge）协同固定配体。这种"三位一体"的识别模式使其对黄嘌呤的亲和力（K_d=12.1 μM）远超其他嘌呤类似物。

研究采用X射线晶体学解析了Paenibacillus beijingensis来源的天然核糖开关（2.1 ?）和嵌合体xanthine-II-ML2/3（2.5 ?）的复合物结构，结合ITC验证了关键残基的功能。通过结构比对发现，尽管与鸟嘌呤核糖开关共享三向连接（three-way junction）骨架，但xanthine-II riboswitch通过新增的碱基对（如A41·C59、A10·A61）延伸了P3茎，形成更复杂的连接区架构。长距离相互作用分析显示，L2-L3环间的非经典碱基对（如A19·A53）和多重碱基层（如A7-C36-U65三联体）共同维持了结合口袋的稳定性。

在应用转化方面，研究创新性地将xanthine-II riboswitch与Pepper荧光适体融合，构建的XP3生物传感器对1 mmol/L黄嘌呤产生10倍荧光增强，且对尿酸（uric acid）、次黄嘌呤（hypoxanthine）等类似物无响应。这种pH敏感性（仅结合中性黄嘌呤）的设计，为临床样本检测提供了特异性保障。

该研究不仅阐明了核糖开关家族通过局部突变实现配体特异性的进化机制，更通过结构指导的理性设计，推动了RNA生物传感器在代谢疾病诊断中的应用。相比蛋白质传感器，这种基于RNA的检测工具具有分子量小、易于基因编码等优势，为实时监测细胞内黄嘌呤动态提供了新范式。论文成果发表于《Science China Life Sciences》，展现了我国在RNA结构生物学领域的前沿探索。

【关键技术方法】

1. X射线晶体学：解析天然和突变型xanthine-II riboswitch与黄嘌呤的复合物结构（最高分辨率2.1 ?）
2. 等温滴定量热法（ITC）：定量测定野生型与突变体的结合亲和力及热力学参数
3. 嵌合体设计：将Desulfosporosinus youngiae的L2/L3环区移植至P. beijingensis骨架
4. 荧光生物传感器构建：通过茎区融合策略联用xanthine-II riboswitch与Pepper适体

【研究结果】

1. 结构解析：发现xanthine-II riboswitch通过U8-A38碱基对和A7-C36-U65三联体"夹心"固定黄嘌呤，关键G37与C64形成特异性氢键网络
2. 突变验证：ITC证实破坏长距离相互作用（如A19C/U20C）或结合口袋残基（如G37U）会完全丧失黄嘌呤结合能力
3. 特异性机制：pH依赖性实验显示仅识别中性黄嘌呤（pH 7.5时K_d=25.2 μM，pH 8.5无结合）
4. 应用开发：优化后的XP3传感器在1 mmol/L黄嘌呤下实现10倍信噪比提升

【结论与展望】
该研究系统揭示了xanthine-II riboswitch通过局部重构实现从鸟嘌呤到黄嘌呤识别的分子开关机制，其结构特征为理解核糖开关的演化提供了范例。所开发的生物传感器克服了传统抗体检测的局限性，有望应用于痛风等疾病的早期筛查。未来通过定向进化优化结合亲和力，或可进一步拓展其在活体成像中的应用潜力。