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在罕见病诊断中，部分基因特异性表型患者的测序数据难以得出结论。研究人员针对此，以歌舞伎综合征 1 型（KS1）为研究主题，通过 DNA 甲基化分析及反向基因分型策略，发现 KMT2D 基因中 AluY 插入是 KS1 新病因，为罕见病诊断提供新思路。
在生命科学和医学领域，罕见病的诊断一直是个难题。歌舞伎综合征 1 型（Kabuki syndrome type 1，KS1）是一种由 KMT2D 基因致病性变异引起的常染色体显性单基因疾病，患者通常伴有综合征性智力障碍、典型面部特征、出生后生长迟缓、小头畸形、畸形综合征和自身免疫性疾病等症状 。以往，对于一些具有典型 KS1 特征的患者，使用传统的下一代测序（Next-generation sequencing，NGS）技术进行基因检测时，却无法明确病因，这使得患者的精准诊断和后续治疗面临困境。
为了解决这一问题，来自法国蒙彼利埃大学医院临床遗传学系、加拿大伦敦健康科学中心 Verspeeten 临床基因组中心等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们通过对一名具有典型 KS1 特征，但 NGS 分析结果不确定的个体进行研究，发现了一种新的致病机制，即 KMT2D 基因中的 AluY 插入。这一发现不仅为 KS1 的发病机制提供了新的见解，还强调了重新分析不确定测序数据的重要性，同时也凸显了 DNA 甲基化特征（episignature）作为罕见病诊断工具的可靠性。该研究成果发表在《Clinical Epigenetics》杂志上。
研究人员在本次研究中主要运用了以下关键技术方法：首先是基因 panel 和外显子组测序，利用 NGS 技术对目标个体的外显子区域及侧翼剪接位点进行测序，分析单核苷酸变异（Single-nucleotide variants，SNVs）和结构变异（Structural variants，SVs）；其次是 DNA 甲基化分析，使用临床验证的 EpiSign 检测方法，通过特定流程处理数据并生成疾病特异性的甲基化变异致病性（Methylation variant pathogenicity，MVP）分数，以此判断疾病；最后是 PCR 分析和断点测序，通过设计特定引物对 KMT2D 基因的特定区域进行扩增和测序，验证 Alu 元件插入的存在及特征。研究样本来自一名具有典型 KS1 特征的患者及其健康父母。
临床描述和分子检测
研究中的个体是健康且无血缘关系的父母所生的第一个孩子。出生时伴有多种畸形，如房室间隔缺损、单脐动脉、半椎体和膈疝等，还存在面部不对称、高拱腭、喂养困难和新生儿低血糖等问题。3 岁时，基于典型面部特征和相关发育迟缓等表现，考虑诊断为 KS1，但针对性的基因 panel 测序和 trio 外显子组测序均未检测到 KMT2D 和 KDM6A 基因的致病性变异。16 岁时，该个体出现智力残疾、身材矮小和已手术矫正的扁平足，免疫球蛋白水平和免疫表型结果正常。
DNA 甲基化分析
利用 EpiSign 变异靶向分析发现，该个体全基因组 DNA 甲基化谱与歌舞伎综合征一致。其甲基化特征不仅与 KMT2D 或 KDM6A 基因致病性变异个体的甲基化模式相符，还通过欧几里得聚类、多维缩放分析和较高的 MVP 分数（1.0），与其他遗传疾病的既定甲基化特征明显区分开来，这表明该个体的甲基化特征高度指向歌舞伎综合征。
反向基因分型方法
研究人员回顾性重新评估之前的基因 panel 测序数据，利用 Integrative Genomics Viewer（IGV）软件仔细分析，发现 KMT2D 基因外显子 36 存在一个小的杂合插入，其具有异常的软剪辑读数和多聚（T）轨迹，且该区域覆盖深度增加。通过计算机模拟从 BAM 文件中检索到插入序列，经 RepeatMasker 工具分析，证实其与 Alu 元件 100% 匹配。随后，PCR 分析进一步确认了 KMT2D 基因外显子 36 的杂合插入，断点分析表明插入序列为 335bp，包含 Alu 元件核心（281bp）、多聚（A）尾（38bp）和 16bp 的靶位点重复（Target site duplication，TSD）。
在讨论部分，研究人员指出，Alu 元件是短散在核元件（Short interspersed nuclear elements，SINEs）家族中的逆转录转座子，可通过靶引物逆转录（Target-primed reverse transcription，TPRT）机制在基因组中传播。以往研究表明，Alu 元件可通过多种分子机制导致单基因疾病，如在基因组水平引起结构重排，在转录水平影响基因表达等。本次研究中发现的 AluY 插入，经预测会导致 KMT2D 基因功能丧失，产生截断变异。但目前还需要进一步的体外 mRNA 和 / 或蛋白质功能研究来明确 KMT2D 基因表达是否因该插入而降低。
此外，早期基因 panel 和外显子组测序未能检测到 Alu 元件插入，可能是由于当时的生物信息学流程和变异检测工具不够优化，无法识别这类非典型结构变异。如今，专门的算法如 Mobile Element Locator Tool（MELT）和新兴技术如长读长测序（Long-read sequencing，LRS）、光学基因组映射（Optical genome mapping，OGM）等，在检测此类变异方面具有优势，有望为罕见病的精准诊断提供更有力的支持。
总的来说，该研究意义重大。它揭示了 Alu 元件插入是 KS1 的一种新的分子致病机制，完善了 KS1 的遗传图谱；强调了对具有基因特异性表型但测序结果不确定的个体，重新分析数据的重要性，有助于发现罕见的致病机制；同时也再次证明了 episignature 分析在罕见病诊断中的可靠性，随着相关技术的不断发展，将为罕见病的精准诊断和个性化医疗开辟新的道路。
