编辑推荐：
帕金森病（PD）治疗手段有限，研究人员探究依帕司他（Epalrestat，EPS）对 PD 的作用。研究发现，EPS 可通过激活 KEAP1/Nrf2 通路减轻氧化应激和线粒体功能障碍，保护多巴胺能（DAergic）神经元，为 PD 治疗提供新方向。
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的慢性神经退行性疾病，随着全球老龄化加剧，其患病率逐年上升。目前临床上治疗 PD 主要采用多巴胺替代疗法，但这种方法只能缓解症状，缺乏神经保护和疾病修饰功能，且长期使用会产生副作用。因此，寻找新的疾病修饰药物迫在眉睫。
在这样的背景下，青岛大学等研究机构的研究人员开展了一项关于依帕司他（Epalrestat，EPS）对帕金森病作用的研究。研究发现，EPS 能够通过激活 KEAP1/Nrf2 通路，减轻氧化应激和线粒体功能障碍，进而减少多巴胺能神经元的损伤，对帕金森病起到神经保护作用。这一研究成果发表在《Journal of Neuroinflammation》上，为帕金森病的治疗提供了新的潜在药物和治疗思路，有望改善目前帕金森病的治疗现状。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：首先构建了 1 - 甲基 - 4 - 苯基吡啶离子（MPP?）处理的 PD 细胞模型和 1 - 甲基 - 4 - 苯基 - 1,2,3,6 - 四氢吡啶（MPTP）处理的 PD 小鼠模型；采用细胞实验，检测细胞活力、凋亡等指标；通过动物行为学实验，如旷场实验（Open field test，OFT）、转棒实验（Rotarod test）等评估小鼠运动功能；运用网络药理学分析预测 EPS 治疗 PD 的潜在机制；利用分子对接、表面等离子共振（Surface plasmon resonance，SPR）等技术验证 EPS 与 KEAP1 的结合。
EPS 改善 MPP?/MPTP 处理的 PD 模型运动功能并减轻 DAergic 神经元损伤
研究人员给 MPTP 诱导的 PD 小鼠模型腹腔注射不同剂量（25mg/kg、50mg/kg 和 100mg/kg）的 EPS，随后进行多项行为学测试。结果显示，50mg/kg 和 100mg/kg 的 EPS 可增加 PD 小鼠在旷场实验中的运动距离，改善转棒实验和爬杆实验的成绩，还能增加中脑黑质（substantia nigra，SN）中 TH 蛋白表达水平，因此后续实验选择 50mg/kg 作为治疗剂量。步态分析表明，EPS 处理可提高小鼠平均跑步速度，减少跑步持续时间、站立时间、摆动时间和步周期。此外，EPS 能改善 MPTP 诱导的 DAergic 神经元丢失，增加 TH 蛋白表达，提高 Bcl - 2/Bax 蛋白比值，还可补偿 MPTP 处理后小鼠纹状体组织中多巴胺（Dopamine，DA）及其衍生物水平的下降。在细胞实验中，100μM 的 EPS 对 MPP?处理的 N2a 细胞具有最强的抗细胞毒性作用，能逆转 MPP?诱导的细胞凋亡，提高细胞内 Bcl - 2/Bax 蛋白比值。
EPS 减轻 MPP?/MPTP 处理的 PD 模型的氧化应激和线粒体功能障碍
氧化应激和线粒体损伤与 PD 中神经元细胞的功能障碍或死亡密切相关。研究人员检测了 N2a 细胞中活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和抗氧化剂（超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase，SOD、过氧化氢酶 Catalase，CAT、谷胱甘肽 Glutathione，GSH 和还原型辅酶 II Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）水平，发现 EPS 可显著消除 MPP?产生的细胞内 ROS，阻止细胞内 MDA 升高，逆转 MPP?诱导的抗氧化酶 SOD 和 CAT 的减少，增加细胞内 GSH 和 NADPH 含量。在 PD 动物模型中，EPS 也能降低 MDA 积累，增加 SOD、CAT 和 GSH 水平。在线粒体功能方面，EPS 可减轻 MPP?引起的线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，Δψm）损伤，改善线粒体超微结构，减少线粒体超氧阴离子和游离钙水平，稳定 ATP 水平。
网络药理学分析预测 EPS 治疗 PD 的潜在机制
为了解 EPS 治疗 PD 的调控机制，研究人员进行网络药理学分析。他们从多个数据库筛选出 EPS 的潜在靶点和 PD 相关靶点，经交集分析得到 78 个 EPS - PD 共同靶点。构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（Protein–protein interaction，PPI）网络并计算核心调控网络，发现 KEAP1 是介导 EPS 治疗 PD 的潜在有效靶点。GO 和 KEGG 富集分析表明，这些交集靶点涉及凋亡、氧化还原反应、谷胱甘肽代谢等生物学过程。基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）显示，PD 模型组中 Nrf2 下调，KEAP1 在 PD 患者和动物模型组的 mRNA 转录水平上调，而 NFE2L2 下游基因表达下调，提示 KEAP1/Nrf2 信号通路在 PD 中受到抑制，支持了 EPS 通过调节该通路在 PD 治疗中发挥作用的观点。
EPS 与 KEAP1 结合促进 Nrf2 信号通路激活
基于网络药理学和生物信息学分析结果，研究人员推测 EPS 可能靶向 PD 中的 KEAP1/Nrf2 通路。分子对接结果显示，EPS 与 KEAP1 的 Kelch 结构域具有高亲和力。SPR 实验证实 EPS 与 KEAP1 的相互作用具有浓度依赖性，细胞热迁移实验（Cellular thermal shift assay，CETSA）表明 EPS 增强了 KEAP1 的热稳定性。免疫印迹分析发现 EPS 可促进 KEAP1 降解，进一步研究确定 EPS 直接结合 KEAP1 的 ASN414 位点。当 KEAP1 的 ASN414 位点突变后，EPS 对细胞的保护作用显著减弱。此外，EPS 可促进 Nrf2 核转位，增加 Nrf2 下游抗氧化靶基因 GCLC、HO - 1 和 NQO1 的 mRNA 和蛋白质表达水平，表明 EPS 通过直接与 KEAP1 相互作用激活 Nrf2 通路。
EPS 通过激活 KEAP1/Nrf2 通路在 MPP?处理的 N2a 细胞中发挥抗氧化和神经保护作用
为证实 EPS 是否通过激活 Nrf2 保护神经细胞，研究人员用 Nrf2 特异性抑制剂 ML385 处理和 siNrf2 转染 N2a 细胞。CCK - 8 实验结果显示，ML385 和 Nrf2 沉默加剧了 MPP?诱导的细胞损伤，消除了 EPS 的保护作用。Nrf2 沉默还加剧了 MPP?诱导的细胞凋亡，削弱了 EPS 的抗凋亡能力，增加了细胞对 MPP?毒性的敏感性，降低了抗氧化酶水平，破坏了线粒体功能，抵消了 EPS 的线粒体保护作用，证实了 EPS 通过激活 Nrf2 通路发挥抗氧化和神经保护作用。
抑制 Nrf2 减弱 EPS 对 MPTP 处理的 PD 小鼠的抗氧化能力和治疗活性
在体内实验中，免疫荧光结果表明 EPS 可增加小鼠 SN 中 Nrf2 水平并促进其核转位，同时降低 KEAP1 水平，上调 Nrf2 下游靶基因表达。研究人员通过注射 pAAV - TH 启动子 - EGFP - mir155（Nfe2 l2） - SV40 PolyA 选择性敲低 TH?神经元中的 Nrf2，结果显示敲低 Nrf2 加剧了 MPTP 处理的 PD 小鼠的运动障碍，消除了 EPS 对运动损伤的改善作用，减少了 TH?神经元数量和 TH 蛋白水平，降低了 DA 水平，增加了 MDA 含量，表明 EPS 通过激活 Nrf2 在 MPTP 处理的 PD 小鼠中发挥抗氧化和神经保护作用。
研究结论和讨论部分指出，帕金森病是一种难以治愈且全球发病率不断上升的神经系统疾病，现有治疗方法存在诸多局限性。药物再利用是一种有前景的策略，EPS 作为已批准用于临床治疗糖尿病周围神经病变的药物，在本研究中显示出对帕金森病的神经保护作用。其作用机制是通过直接结合 KEAP1 激活 KEAP1/Nrf2 信号通路，减轻氧化应激和线粒体功能障碍，保护 DAergic 神经元。尽管本研究为帕金森病治疗提供了新方向，但仍需进一步研究明确 EPS 作为辅助药物的治疗效果。总之，该研究为帕金森病的治疗带来了新的希望，为后续研究和临床应用奠定了基础。
