揭秘蓝舌病毒 VP7 蛋白：单克隆抗体与 B 细胞表位图谱绘制助力诊断与疫苗研发

蓝舌病毒（BTV）严重影响反刍动物健康，其诊断和防控面临挑战。研究人员制备抗 BTV VP7 蛋白单克隆抗体（mAbs）并绘制 B 细胞表位图谱。结果发现 6 种 mAbs 识别 4 个保守表位，部分 mAbs 存在交叉反应。该研究为 BTV 诊断和疫苗开发提供关键依据。

　　蓝舌病是一种由蓝舌病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的，通过媒介传播的病毒性疾病，主要影响野生和家养的反刍动物，如绵羊、山羊、牛、水牛和鹿等。BTV 有多种血清型，目前已发现多达 36 种，其中有 24 种 “典型” 血清型和几种 “非典型” 血清型 。蓝舌病主要流行于热带和亚热带地区，但随着气候变化、受感染动物和媒介物种的移动，其感染范围不断扩大，给畜牧业带来了巨大的经济损失。

BTV 属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus），其基因组由十条线性双链 RNA 片段组成，编码七种结构蛋白（VP1 - VP7）和四种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4）。VP7 蛋白是 BTV 核心表面的重要组成部分，由 260 个 VP7 三聚体构成，每个三聚体包含两个不同的结构域。VP7 不仅在病毒装配中发挥作用，还是血清群特异性的主要决定因素，可用于建立检测 BTV 抗体的血清学诊断方法。然而，由于 BTV 与流行性出血病病毒（Epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）等相关病毒存在结构、抗原和分子上的相似性，且都通过吸血昆虫（库蠓）传播，导致在诊断时容易出现混淆，现有的血清学诊断方法，如间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID），因交叉反应无法清晰区分 BTV 和 EHDV 血清群的抗体 。因此，开发更精准的诊断方法和有效的疫苗迫在眉睫。

为了解决这些问题，中国农业科学院兰州兽医研究所的研究人员开展了相关研究。他们通过一系列实验，成功制备了六种针对 BTV - 1 VP7 蛋白的单克隆抗体（mAbs），并对其相应的 B 细胞抗原表位进行了定位。这一研究成果发表在《Virology Journal》上，为深入理解 BTV VP7 蛋白的结构和功能提供了重要依据，也为建立更准确的诊断方法和开发基于表位的肽疫苗奠定了基础。

研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先是蛋白表达与纯化技术，将优化后的 BTV - 1 VP7 基因导入大肠杆菌表达系统，诱导表达重组 VP7 蛋白（rec - VP7），并利用亲和层析进行纯化。其次是单克隆抗体制备技术，用纯化的 rec - VP7 免疫 BALB/c 小鼠，通过细胞融合、筛选和亚克隆获得单克隆抗体。此外，还运用了免疫分析技术，如 Western blotting、ELISA 和免疫荧光测定（IFA），用于鉴定 mAbs 的反应性；采用基因工程技术，构建表达一系列 VP7 截断肽，以定位 mAbs 识别的表位；利用生物信息学分析技术，对 VP7 氨基酸序列进行比对和结构分析。

研究结果如下：

• 重组 VP7 蛋白的表达与纯化：将重组质粒 pET - BTVVP7 转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中表达，SDS - PAGE 结果显示 rec - VP7 蛋白分子量约为 40 KDa，主要存在于沉淀中，经 Ni - NTA 琼脂糖纯化后，可被抗 6×His 标签单克隆抗体和兔抗 BTV - 1 阳性血清识别。
• 单克隆抗体的制备与鉴定：通过间接 ELISA 筛选出阳性杂交瘤细胞克隆，经多次亚克隆获得 2A7、2B2、2B3、2D3、2D7 和 2H2 六种 mAbs。Western blotting 和 IFA 结果表明，这六种 mAbs 均可与 rec - VP7 和 BTV - 1 感染的 BHK - 21 细胞中的天然 VP7 反应。同型鉴定显示，2A7 和 2D7 为 IgG2b 亚类，2B2、2B3 和 2H2 为 IgG2a 亚类，2D3 为 IgG1 亚类。
• mAbs 识别表位的定位：将 VP7 序列截短为三个片段进行表达，初步确定 2A7、2B2、2B3 和 2D3 识别 F1 片段，2D7 和 2H2 识别 F3 片段。进一步两轮截短和验证，确定 2A7 识别的表位为 71^SAAGINVGPI80，2B3 识别 110^ARVTGETSTWG120，2B2 和 2D3 识别 125^PYGFFLETEET135，2D7 和 2H2 识别 332^VNPMPGPLTRA342。
• 同源性和交叉反应分析：对 BTV、非洲马瘟病毒（African horse sickness virus，AHSV）和 EHDV 的 VP7 氨基酸序列分析显示，部分表位在 BTV 典型血清型中保守，但在 AHSV 和 EHDV 中不保守。交叉反应分析表明，2A7 可与 BTV、AHSV 和 EHDV 的 rec - VP7 蛋白反应；2B2、2B3 和 2D3 可与 BTV 和 EHDV 的 rec - VP7 蛋白反应；2D7 和 2H2 仅特异性识别 BTV VP7。
• BTV VP7 的生物信息学分析：利用 SWISSMODEL 预测 VP7 的三维结构，发现 2B2 和 2D3 的抗原表位位于顶部结构域核心，2A7、2B3、2D7 和 2H2 的表位位于底部结构域。71^SAAGINVGPI80 位于 N 端，332^VNPMPGPLTRA342 位于 C 端，且均暴露于三聚体表面。BTV - 1、AHSV - 1 和 EHDV - 1 的 VP7 结构高度相似。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功制备了六种针对 BTV VP7 蛋白的 mAbs，并定位了其识别的四个 B 细胞线性表位。这些表位在 BTV 不同血清型中的保守性，以及 mAbs 与相关病毒 VP7 蛋白的交叉反应性差异，为进一步理解 BTV VP7 的结构和功能提供了重要线索。其中，2D7 和 2H2 仅特异性识别 BTV VP7，可作为 BTV 和 EHDV 血清学鉴别诊断方法的候选抗体。此外，鉴定出的抗原表位有助于设计基于肽和亚单位的 BTV 疫苗，为蓝舌病的防控提供了新的思路和潜在的解决方案，对保障畜牧业健康发展具有重要意义。