MARCH8：抗击口蹄疫病毒的关键宿主因子，开启抗病毒新征程

口蹄疫病毒（FMDV）严重影响畜牧业，其与宿主蛋白的相互作用尚不明晰。研究人员开展 MARCH8 对 FMDV 复制影响的研究，发现 MARCH8 能抑制 FMDV 复制，这为控制 FMDV 感染提供了潜在策略。

　　在畜牧业的广袤天地里，口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）就像一场可怕的瘟疫，时刻威胁着家畜的健康。它由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）引发，这种病毒极具传染性，能在短时间内迅速传播，给养殖业带来巨大的经济损失。FMDV 有着令人头疼的遗传多样性和抗原变异性，而且感染牛羊等家畜后，不少动物还会持续感染，这使得病毒不断发生遗传重配，新的病毒毒株层出不穷，防控工作难上加难。

在这场与病毒的战斗中，宿主蛋白和病毒之间的相互作用至关重要。FMDV 依赖宿主蛋白完成自身生命周期，而宿主也会启动各种抗病毒机制来对抗病毒入侵。但狡猾的 FMDV 进化出了多种逃避宿主防御的策略，比如切割宿主抗病毒蛋白、抑制干扰素产生等。因此，深入了解 FMDV 和宿主蛋白之间的 “恩怨情仇”，成为了攻克这一难题的关键。

为了揭开这个谜团，华中农业大学和中国农业科学院兰州兽医研究所等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们将目光聚焦在膜相关 RING-CH8 蛋白（Membrane-Associated RING-CH8 Protein，MARCH8）上，致力于研究 MARCH8 对 FMDV 复制的影响。经过一系列艰苦的实验和研究，他们发现 MARCH8 是对抗 FMDV 的重要宿主抗病毒效应因子，这一发现为抗击 FMD 带来了新的希望，相关研究成果发表在《Veterinary Research》杂志上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是通过构建质粒和转染细胞，实现对相关基因的过表达或敲低；二是利用共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）技术，检测蛋白质之间的相互作用；三是借助免疫荧光测定（immunofluorescence assay，IFA）技术，观察蛋白质的定位和共定位情况；四是采用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-PCR，RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术，分别从基因和蛋白质水平检测相关分子的表达变化；五是运用噬斑实验（Plaque assay）测定病毒滴度，评估病毒的复制能力。

下面来看看具体的研究结果：

• MARCH8 负向调节 FMDV 复制：研究人员在猪肾细胞（SK6）中过表达 MARCH8，然后用 FMDV O/HN/CHA/93 毒株感染细胞。通过蛋白质免疫印迹和噬斑实验发现，随着 MARCH8 表达量增加，FMDV 的 VP1 蛋白表达量下降，病毒滴度也显著降低，而且这种抑制作用呈剂量依赖性。同时，敲低内源性 MARCH8 后，VP1 蛋白表达量和病毒滴度都明显上升。这一系列实验表明，MARCH8 能有效抑制 FMDV 复制。
• MARCH8 与 VP1、VP2 和 VP3 相互作用：为了探究 MARCH8 抑制 FMDV 复制的机制，研究人员进行了一系列实验。他们先通过共免疫沉淀实验，发现 MARCH8 能与 FMDV 的结构蛋白 VP1、VP2 和 VP3 相互作用。接着，反向免疫沉淀和共聚焦显微镜分析进一步证实了这种相互作用，并且观察到它们在细胞质中共定位。这说明 MARCH8 与 VP1、VP2 和 VP3 之间存在紧密联系，很可能是抑制 FMDV 复制的关键。
• MARCH8 通过蛋白酶体途径降解 VP1、VP2 和 VP3 蛋白：研究人员发现 MARCH8 与 VP1、VP2 和 VP3 相互作用后，推测 MARCH8 可能影响这些病毒蛋白的表达。在 HEK293T 细胞和 SK6 细胞中进行的实验表明，随着 MARCH8 表达量增加，VP1、VP2 和 VP3 的蛋白水平逐渐下降。随后，他们用蛋白酶体抑制剂 MG132、溶酶体抑制剂 NH₄Cl 和泛半胱天冬酶抑制剂 ZVAD-FMK 处理细胞，结果发现只有 MG132 能恢复 VP1、VP2 和 VP3 的蛋白水平。这就明确了 MARCH8 是通过蛋白酶体途径介导 VP1、VP2 和 VP3 的降解。
• MARCH8 催化 VP1、VP2 和 VP3 的 K33 连接的多聚泛素化：泛素化在对抗病毒感染中起着重要作用，研究人员猜测 MARCH8 可能通过泛素化 VP1、VP2 和 VP3 来发挥作用。实验结果显示，过表达 MARCH8 会增加 VP1、VP2 和 VP3 的泛素化水平。进一步研究发现，当细胞共转染 K33 泛素时，MARCH8 介导的 VP1、VP2 和 VP3 的泛素化水平显著提高，而当泛素的第 33 位赖氨酸被精氨酸取代（K33R 泛素）时，MARCH8 不再增加它们的泛素化水平。这表明 MARCH8 特异性催化 VP1、VP2 和 VP3 的 K33 连接的多聚泛素化。
• MARCH8 在特定位点介导 VP1、VP2 和 VP3 的降解：通过对 FMDV 不同血清型的 VP1、VP2 和 VP3 进行序列分析，研究人员确定了一些保守的赖氨酸残基。构建这些残基的突变体后发现，VP1_K210R、VP2_K63R和 VP3_K118R突变体对 MARCH8 介导的降解具有抗性。进一步实验表明，K210、K63 和 K118 是 MARCH8 介导的 VP1、VP2 和 VP3 泛素化的关键位点。虽然破坏 VP1 的 K210 位点不影响 FMDV 的复制能力，且突变病毒 rO/HN/93-K210R 仍对 MARCH8 的抑制敏感，但 VP2 的 K63 位点和 VP3 的 K118 位点可能对 FMDV 的拯救和复制至关重要，还需要进一步研究。
• MARCH8 的 W112 位点对 VP1、VP2 和 VP3 的降解至关重要：MARCH8 的 RING-CH（ZF）结构域具有 E3 泛素连接酶活性，研究人员构建了该结构域的失活突变体 MARCH8_W112A。实验发现，MARCH8_W112A无法降低 VP1、VP2 和 VP3 的蛋白表达，也不能与它们相互作用。这说明 MARCH8 的 E3 泛素连接酶活性对 VP1、VP2 和 VP3 的降解必不可少。
• MARCH8 通过其 ZF 和 TM 结构域抑制 FMDV 复制：研究人员发现，虽然 MARCH8_W112A仍能部分抑制 FMDV 复制，但抑制效果比野生型 MARCH8 弱，这表明 MARCH8 的 E3 泛素连接酶活性部分参与了其抗 FMDV 活性。此外，构建缺失 ZF 和跨膜（TM）结构域的 MARCH8 突变体（△ZF + TM）后发现，该突变体无法抑制 FMDV 复制。这充分说明 ZF 和 TM 结构域对 MARCH8 的抗 FMDV 活性至关重要。

综合上述研究，MARCH8 通过介导 VP1、VP2 和 VP3 的 K33 连接的多聚泛素化和蛋白酶体降解，抑制 FMDV 的复制，而且其 ZF 和 TM 结构域在这一过程中发挥着关键作用。这项研究首次揭示了 MARCH8 对 FMDV 复制的影响，拓展了 MARCH8 的抗病毒谱，为深入理解宿主与 FMDV 的相互作用机制提供了新的视角，也为控制 FMDV 感染提供了潜在的策略，在抗击口蹄疫的道路上迈出了重要的一步。