揭秘天使综合征：Kv4.2 蛋白降解机制与潜在治疗新靶点

本文聚焦于天使综合征（AS），发现电压门控 K+通道 Kv4.2 是 UBE3A 的活性依赖底物。在 AS 小鼠模型中，Kv4.2 蛋白水平异常，其活性依赖降解受损。敲除 Kv4.2 可改善相关生理和行为缺陷，为 AS 治疗提供了潜在靶点和新方向。

　　

研究背景

天使综合征（Angelman syndrome，AS）是一种严重的神经发育障碍疾病，发病率约为 1/20,000，主要特征包括智力障碍、运动协调受损、癫痫发作、睡眠障碍、焦虑增加、语言缺失以及与自闭症谱系障碍的高共病率。其主要病因是人类 15 号染色体 q11 - 13 区域印记基因功能丧失，或该区域内泛素连接酶 E3A（UBE3A）基因突变或缺失。UBE3A 基因编码的蛋白在海马神经元等神经细胞中由母源等位基因特异性表达，主要作为 E3 连接酶参与泛素依赖的蛋白质降解过程。
目前虽已明确 UBE3A 基因与 AS 的关联，但下游信号通路仍不明确。此前研究发现一些神经元蛋白是 UBE3A 的底物，如 Ephexin5、小电导钾（SK2）通道和钙电压依赖大钾（BK）通道等，但仍有新的底物有待发现。Kv4.2 是海马 CA1 区锥体细胞树突上表达的主要 A 型电压门控钾通道，它对调节树突兴奋性、神经元可塑性以及学习和记忆过程起着重要作用，并且 Kv4.2 通道与辅助亚基形成大分子蛋白复合物，共同调节其功能。基于此，研究人员推测 Kv4.2 可能与 AS 的发病机制相关，开展了一系列研究。

研究方法

1. 实验动物：使用多种小鼠模型，包括 AS 小鼠（Ube3a^{m - /p +}）、Kv4.2 条件性敲除小鼠（Kv4.2cKO，Emx1 - cre/KCND2^F/F）、DPP6 敲除小鼠（DPP6^?/?）等。通过特定的交配策略繁殖小鼠，并利用 PCR 和测序技术进行基因分型。
2. 细胞实验：培养大鼠海马神经元和 HEK 293T 等细胞系，进行转染实验以研究蛋白之间的相互作用、磷酸化和泛素化等过程。
3. 蛋白分析技术：运用串联亲和纯化 - 质谱（TAP - MS）技术鉴定与 Kv4.2 相互作用的蛋白；采用免疫共沉淀（coIP）、免疫印迹（western blot）、体外泛素化实验等方法研究蛋白的结合、修饰和降解；通过亚细胞分级分离技术分析 Kv4.2 在不同细胞组分中的表达水平。
4. 电生理记录：对小鼠海马脑片进行全细胞电流钳记录、外向体细胞斑片记录、微小兴奋性 / 抑制性突触后电流（mEPSC/mIPSC）记录、诱发兴奋性突触后电流（eEPSC）记录以及尖峰时序依赖的长时程增强（STD LTP）记录，以研究神经元的电生理特性和突触可塑性。
5. 行为学测试：对小鼠进行旷场实验、加速转棒实验、埋珠实验、筑巢实验、恐惧条件反射实验和杠杆按压实验，评估小鼠的运动能力、学习记忆能力、认知灵活性等行为学表现。

研究结果

1. UBE3A 与 Kv4.2 的相互作用：利用 TAP - MS 技术发现，在神经元活动刺激下，UBE3A 与 Kv4.2 结合。AMPA 处理培养的海马神经元后，通过 western blot 和 coIP 实验证实了这种结合的增强，且发现 UBE3A 与 Kv4.2 的 N 端结合。免疫染色实验进一步表明，KA 处理小鼠后，海马 CA1 区放射层中 UBE3A 与 Kv4.2 的共定位显著增加。
2. Kv4.2 的泛素化及降解机制：研究发现 Kv4.2 可被 UBE3A 泛素化，且主要发生在 K103 位点。体外泛素化实验确定了 K103 是 UBE3A 特异性泛素化位点，突变该位点会影响 Kv4.2 的泛素化水平。FRET 实验表明，K103 位点的泛素化影响 Kv4.2 的寡聚化。在神经元活动刺激下，Kv4.2 通过 K103 位点的泛素化经蛋白酶体途径降解，AMPA 处理可降低 Kv4.2 蛋白水平，而 MG132 处理可阻断这一过程。
3. AS 小鼠中 Kv4.2 的变化：在 AS 小鼠的海马中，Kv4.2 介导的 A 电流（I_A）密度显著升高，同时 Kv4.2 蛋白在不同亚细胞组分中的水平也明显增加，且 KA 诱导的 Kv4.2 蛋白降解受损。电生理记录显示，AS 小鼠 CA1 区锥体细胞的内在兴奋性降低，输入电阻减小，动作电位发放频率降低，这些变化与 Kv4.2 蛋白水平的增加相关。
4. DPP6 在 Kv4.2 降解中的作用：研究表明，Kv4.2 与 DPP6 形成的复合物在活动依赖的 Kv4.2 降解中起重要作用。p38 磷酸化 Kv4.2 后，Pin1 异构酶促进 UBE3A 与 Kv4.2 的结合，而 Kv4.2 在 Pin1 结合位点 T602/7 的磷酸化以及 DPP6 的存在对 KA 诱导的 Kv4.2 蛋白降解是必需的。在 Kv4.2T607A 小鼠和 DPP6KO 小鼠中，KA 诱导的 Kv4.2 蛋白降解明显受损。
5. Kv4.2cKO 对 AS 小鼠生理和行为缺陷的影响：构建 Kv4.2cKO 小鼠模型，与 AS 小鼠杂交产生双敲除（DKO）小鼠。电生理实验表明，Kv4.2cKO 可完全挽救 AS 小鼠中 mEPSC 频率的增加，但对 mEPSC 幅度无明显影响，提示 Kv4.2 参与调节 AS 小鼠海马中兴奋性突触的数量。此外，Kv4.2cKO 可完全挽救 AS 小鼠中 STD LTP 的缺失，表明 Kv4.2 的失调是 AS 小鼠海马中 STD LTP 丧失的关键因素。
   行为学测试发现，在多种行为学实验中，Kv4.2cKO 对 AS 小鼠的行为缺陷有不同程度的改善。在旷场实验中，DKO 小鼠纠正了 AS 小鼠的运动缺陷；在筑巢实验中，DKO 小鼠相比 AS 小鼠在筑巢能力上有所提高；在杠杆按压实验的逆转学习阶段，DKO 小鼠相比 AS 小鼠表现出显著的改善，表明 Kv4.2 参与调节认知灵活性。

研究讨论

本研究确定了 Kv4.2 复合物是 UBE3A 的新靶点，揭示了其在 AS 病理中的作用机制。活动依赖的 DPP6 - 包含 Kv4.2 复合物的降解由 UBE3A 调节，这一过程影响神经元可塑性和认知灵活性，为 AS 小鼠认知障碍提供了潜在机制。
研究发现 AS 小鼠海马中兴奋性传递增强，抑制性传递未改变，导致兴奋性 / 抑制性传递失衡，而 Kv4.2 在调节这种失衡中起重要作用。Kv4.2cKO 可改善 AS 小鼠的一些生理和行为缺陷，如 mEPSC 频率、STD LTP 以及认知灵活性等，但对其他行为缺陷如运动协调能力的改善效果不明显，这可能与多种因素有关，包括其他 UBE3A 靶点的影响以及不同脑区的复杂调控机制。
此外，研究还存在一些局限性。例如，尚未明确学习和记忆过程是否会触发 Kv4.2 的降解；未探究降低 AS 小鼠中 Kv4.2 的过表达是否足以挽救其表型；实验仅使用了雄性小鼠，未考虑性别差异对结果的影响。未来研究可针对这些方面展开，进一步深入了解 AS 的发病机制和潜在治疗策略。
总体而言，本研究为理解 UBE3A 下游信号通路以及 AS 的病理机制提供了新的视角，通过对 Kv4.2 的研究，为 AS 的治疗提供了潜在的药物靶点和干预方向，有望推动针对 AS 的治疗研究取得新的进展。