N - 乙酰 - L - 半胱氨酸（NAC）抗铁死亡新机制：助力谷胱甘肽过氧化物酶 4 的关键作用

铁死亡（Ferroptosis）在疾病治疗中备受关注，N - 乙酰 - L - 半胱氨酸（NAC）常被用作铁死亡抑制剂。本文研究发现 NAC 不仅是半胱氨酸前药，还可直接作为谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）的还原底物抑制铁死亡，为相关疾病治疗提供新方向。

　　

研究背景

N - 乙酰 - L - 半胱氨酸（NAC）作为一种在多种疾病治疗中应用的药物，其作用机制尚未完全明晰。传统认为它具有二硫键还原和清除氧化剂的作用，但从反应动力学角度来看，这些观点受到了质疑。目前，NAC 作为半胱氨酸前药发挥抗铁死亡效应的观点逐渐被认可。

铁死亡是一种独特的细胞死亡形式，由代谢功能障碍下游的铁依赖性脂质过氧化驱动。它与多种疾病相关，如缺血 - 再灌注损伤、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等，抑制铁死亡成为了有前景的治疗策略。在细胞内，铁死亡的调控与半胱氨酸 / 谷胱甘肽（GSH）/ 谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）轴密切相关。细胞外的胱氨酸经系统 x_c^?进入细胞并被还原为半胱氨酸，半胱氨酸参与 GSH 的生物合成，GSH 则被 GPX4 用于还原潜在有害的（磷酸）脂质氢过氧化物，从而防止铁死亡。此外，细胞内半胱氨酸还可生成硫化氢和硫烷硫物种，部分能以 GPX4 非依赖的方式抑制铁死亡。

研究目的

本研究旨在探究 NAC 抑制铁死亡的潜在机制，明确 NAC 及其对映体 N - 乙酰 - D - 半胱氨酸（D-NAC）在铁死亡抑制过程中的具体作用方式，以及它们与 GPX4 等关键分子的关系。

研究方法

1. 细胞实验：选用野生型（WT）小鼠成纤维细胞 Pfa1 和人纤维肉瘤 HT1080 细胞等多种细胞系。通过向细胞中添加不同的诱导剂（如 erastin、sulfasalazine 等）和抑制剂（如 RSL3、ML162 等），观察细胞死亡情况和形态变化。利用基因编辑技术构建敲除或过表达特定基因的细胞系，如 Slc7a11 敲除（Slc7a11^KO）、Gclc 敲除（Gclc^KO）、mSlc7a11 过表达（mSlc7a11^OE）等细胞系，研究相关基因在铁死亡过程中的作用。
2. 体外实验：进行 GPX4 酶活性测定，通过制备 16:0 - 20:4 磷脂酰胆碱氢过氧化物（PCOOH），利用亲和纯化的 GPX4，检测在不同底物存在下 PCOOH 的还原情况，以此判断底物是否能被 GPX4 利用。采用 LC-MS/MS 技术，检测细胞内半胱氨酸、GSH 水平以及 NAC 和 D-NAC 的氧化产物等。

研究结果

1. D-NAC 保护细胞免受铁死亡：实验发现，D-NAC 和 NAC 一样，能阻止由 erastin 和 sulfasalazine 诱导的细胞死亡，且在无胱氨酸的培养基中，D-NAC 也能在一定时间内保护 Pfa1 和 HT1080 细胞免受铁死亡。进一步实验表明，D-NAC 的这种保护作用不依赖于细胞外胱氨酸和系统 x_c^?。
2. D-NAC 抗铁死亡不依赖 GSH 合成：用 GSH 生物合成抑制剂 L - 丁硫氨酸亚砜亚胺（BSO）处理细胞，发现 NAC、D-NAC 和铁死亡抑制剂 liproxstatin - 1（Lip-1）能在高浓度 BSO 处理下拯救细胞。在 Gclc^KO细胞中，NAC 和 D-NAC 也能有效拯救细胞，且不恢复 GSH 水平，证明 D-NAC 抗铁死亡效应不依赖 GSH 合成。
3. NAC 和 D-NAC 以 GPX4 依赖方式抗铁死亡：使用一系列 GPX4 抑制剂处理细胞，发现 NAC 和 D-NAC 仅能挽救由 RSL3、ML162 和 ML210 诱导的部分铁死亡，而对 FIN56 和 FINO₂诱导的铁死亡无明显作用。通过基因编辑敲除 Gpx4 基因后，NAC 和 D-NAC 不能再挽救细胞死亡，表明 GPX4 是 NAC 和 D-NAC 发挥抗铁死亡作用的必需条件。体外实验证实，NAC、D-NAC、半胱氨酸和 D - 半胱氨酸都可作为 GPX4 的还原底物，使 GPX4 能够还原 PCOOH，同时产生相应的氧化产物。此外，研究还发现 ferroptosis suppressor protein 1（FSP1）并非 NAC 和 D-NAC 发挥抗铁死亡作用所必需。
4. xCT 过表达和 β-ME 的抗铁死亡作用依赖 GPX4：虽然有研究表明 Pfa1 细胞过表达 xCT 可抵抗 GPX4 缺乏诱导的铁死亡，但本研究发现，在使用高剂量 Tam 敲除 Gpx4 基因后，过表达 xCT 的细胞与 WT 细胞一样死亡，说明 xCT 过表达的抗铁死亡作用依赖 GPX4。体外实验表明，β- 巯基乙醇（β-ME）可作为 GPX4 的还原底物，但它和其他一些还原剂（如 cysteamine、dithiothreitol（DTT）和 tris (2 - 羧乙基) 膦（TCEP））相比，只有 β-ME 在较低浓度下对胱氨酸耗尽诱导的细胞死亡有较强的保护作用，且这些还原剂都不能挽救 Gpx4^KO细胞的死亡，进一步证明它们的抗铁死亡作用依赖 GPX4。

研究结论

本研究明确了 NAC 和 D-NAC 是 GPX4 的真正还原底物。NAC 虽然主要通过补充细胞内 GSH 池发挥抗铁死亡作用，但在 GSH 生物合成受阻或 GSH 耗尽时，NAC 及其代谢产物半胱氨酸也可作为 GPX4 的直接还原底物。此外，研究还发现了多种可作为 GPX4 还原底物的化合物，为深入理解 NAC 的细胞保护机制和铁死亡研究领域提供了有价值的信息。不过，本研究存在一定局限性，仅基于有限的细胞系和体外实验，未来还需在生理条件下进一步探究 NAC 和 D-NAC 作为 GPX4 直接还原底物的潜力。