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结直肠癌（CRC）早期诊断意义重大，现有方法却存在局限。本文通过整合肿瘤和血浆细胞外囊泡（EVs）蛋白质组，筛选出 CRC 诊断生物标志物，构建 ColonTrack 模型，其诊断准确性高，为 CRC 早期诊断和精准医疗提供新方向。
背景与研究目的
结直肠癌（CRC）在全球癌症发病率和死亡率排名中都位居前列。早期发现 CRC 对提高患者生存率至关重要，如局部疾病患者 5 年生存率可达 91%，而转移性病例仅为 14%。然而，现有的 CRC 诊断方法，像结肠镜检查、粪便免疫化学测试、粪便检测等，存在侵入性、成本高、特异性不足等问题。血清生物标志物癌胚抗原（CEA）在 CRC 筛查中的敏感性和特异性也不尽人意。
液体活检作为新兴手段虽有潜力，但通过超深度下一代测序分析基因组 / 表观基因组变异面临诸多挑战，如技术复杂、周转时间长、成本高昂等，循环肿瘤细胞的临床应用也受技术难题限制。细胞外囊泡（EVs）因能包裹多种生物分子，在液体活检中崭露头角。不过，目前对 EV 衍生蛋白质的研究相对较少，且组织和血浆 EV 蛋白质之间的联系尚未充分挖掘。本研究旨在通过整合肿瘤组织和血浆 EV 蛋白质组，寻找可靠的 CRC 诊断生物标志物，并构建高效的诊断模型。
研究方法
- 样本采集与处理：本研究为回顾性、横断面病例对照研究，共纳入 1272 名参与者，样本来自中山医院、连云港市第二人民医院和复旦大学附属肿瘤医院。收集 CRC 患者的肿瘤组织、癌旁组织和血浆样本，以及健康个体和良性疾病（BD）患者的血浆样本。组织样本在手术切除后 30 分钟内获取并处理，血液样本采集后 2 小时内离心处理，血浆保存于 - 80°C 。
- EVs 的分离与鉴定：从组织中分离 EVs 采用密度梯度离心结合尺寸排阻色谱（SEC）柱的方法，从血浆中分离则使用商业试剂盒。通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和免疫印迹对分离的 EVs 进行表征，以确认其形态、大小和 EV 标志物的富集情况 。
- 蛋白质组学分析：运用数据非依赖性采集（DIA）策略对组织和血浆 EVs 进行蛋白质组分析，分别生成混合光谱库。采用平行反应监测（PRM） - MS 对候选生物标志物进行验证，用酶联免疫吸附测定（ELISA）进行最终的生物标志物验证 。
- 数据分析与模型构建：使用 R 语言等对蛋白质组数据进行分析，包括差异丰度分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、基因本体（GO）富集分析和基因集富集分析（GSEA）等。基于 ELISA 数据，利用随机森林算法构建 ColonTrack 模型，并进行内部和外部验证 。
研究结果
- EVs 蛋白质组综合分析：在发现阶段，对 60 名受试者（40 例 CRC 患者和 20 名健康个体）的组织和血浆 EVs 进行蛋白质组分析，共鉴定出 5603 种蛋白质。通过与 Vesiclepedia 数据库对比，证实了分离 EVs 的高纯度。分析发现，CRC 患者的 EVs 分泌水平显著上调，且组织和血浆 EVs 中存在 2088 种共同定量的蛋白质，暗示组织来源的 EVs 可能进入血液循环 。
- 组织 EV 蛋白质组揭示 CRC 代谢重编程：对组织 EVs 中 5556 种定量蛋白质进行 WGCNA 分析，识别出 11 个功能模块，这些模块与生物氧化、细胞质翻译和 mRNA 加工等过程相关。其中，ME09 模块在 PT 和 AM 样本间差异显著，与有氧糖酵解密切相关，表明组织来源的 EVs 能反映 CRC 相关的生理变化，尤其是能量代谢方面的变化 。
- 候选 CRC 生物标志物的发现与验证：通过对血浆数据的差异分析，发现 517 种显著失调的蛋白质。整合血浆和组织 EV 蛋白质组数据后，筛选出 21 种蛋白质作为候选生物标志物。经 PRM - MS 验证，19 种候选蛋白质表达趋势与发现队列一致。进一步通过 ELISA 和机器学习分析，最终确定 CTTN、HNRNPK 和 PSMC6 三种蛋白质，构建了 ColonTrack 模型 。
- ColonTrack 模型的性能评估：ColonTrack 模型在区分 CRC 与非 CRC 病例以及早期 CRC 诊断方面表现出色。在训练集和验证集中，该模型的综合曲线下面积（AUC）大于 0.97，敏感性约为 0.94，特异性约为 0.93，显著优于传统标志物 CEA 和 CA19 - 9。在早期 CRC 诊断中，ColonTrack 模型对 I 期 CRC 患者的敏感性高达 1.000（内部验证）和 0.931（外部验证） 。
- 模型的临床应用价值：ColonTrack 模型不仅能有效区分早期 CRC 与良性肠道疾病（如结直肠腺瘤，CRA），还可用于监测手术治疗效果。术后患者血浆中 CTTN、HNRNPK 和 PSMC6 的表达水平显著下降，模型检测常呈阴性 。与其他诊断指标对比，ColonTrack 模型在早期 CRC 检测方面优势明显，与 mSeptin - 9 联合使用可进一步提高检测率 。
研究讨论
本研究通过整合血浆和组织 EVs 的蛋白质组分析，成功筛选出 CTTN、HNRNPK 和 PSMC6 三种蛋白质组成的生物标志物 Panel，并构建了 ColonTrack 模型。该模型在 CRC 诊断中展现出卓越的性能，尤其是在早期诊断方面，为临床医生提供了一种可靠的非侵入性诊断工具。
HNRNPK 作为 RNA/DNA 结合蛋白，在肿瘤发生、发展和迁移中发挥重要作用；CTTN 参与肌动蛋白细胞骨架动力学调节，与癌细胞迁移和侵袭密切相关；PSMC6 作为 19S 蛋白酶体调节复合物的亚基，在蛋白质稳态和降解途径中具有重要意义 。
与以往研究相比，本研究采用先进的蛋白质组学技术，对组织和血浆 EVs 分别进行检测，获得了更全面的蛋白质信息，提高了生物标志物筛选的准确性。不过，本研究也存在一定局限性。作为回顾性研究，数据可能存在固有偏差，需要在更大规模的前瞻性队列中进行验证。而且样本均来自中国患者，可能无法完全反映其他人群的 CRC 特征。此外，虽然发现的蛋白质有诊断潜力，但可能并非肿瘤特异性，需要更严格的方法验证其相关性和特异性 。
研究展望
未来研究可进一步扩大样本量，纳入不同种族和地域的患者，以提高模型的普适性。深入探究这些生物标志物的生物学机制，有助于开发更有效的治疗策略。同时，将 ColonTrack 模型与其他诊断方法结合，有望实现更精准的 CRC 诊断和个性化治疗，为 CRC 患者带来更好的临床结局。
