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本文通过评估基因型和表型数据来发现线粒体 DNA（mtDNA）疾病。研究开发了 mtDNA 疾病评估流程，在大型欧洲罕见病队列（Solve - RD）中应用，提高了诊断率，为 mtDNA 疾病诊断提供新策略，对罕见病研究意义重大。
线粒体 DNA 疾病研究背景
线粒体 DNA（mtDNA）疾病的诊断在下一代测序（NGS）时代仍颇具挑战。线粒体疾病临床异质性高，至少 1/4300 人受其影响，成人中多数为 mtDNA 相关疾病。其症状多样，从儿童期快速进展的神经退行性疾病，如 Leigh 综合征（MIM：256000），到成人期缓慢进展的疾病，如进行性眼外肌麻痹和线粒体肌病 。而且，mtDNA 疾病的表型谱与常见疾病有重叠，如携带异质性MT - TL1（HGNC：7490）m.3243A>G（GenBank：NC_012920.1）变异的个体，可能出现糖尿病和听力损失（母系遗传糖尿病和耳聋，MIM：520000），也可能更严重地表现为线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作（MELAS，MIM：540000） 。
此外，解释罕见 mtDNA 变异存在诸多困难。一方面，在未患严重神经系统疾病的个体中也检测到致病性 mtDNA 变异，这可能与临床特征的延迟发作或可变外显率有关，且现有数据库可能无法捕捉这些信息。另一方面，缺乏临床验证的血液生物标志物，难以获取先证者和母系亲属的额外样本以确认潜在致病性 mtDNA 变异的分离，以及 mtDNA 变异在血液中的低异质性（而异质性在有丝分裂后组织，主要是肌肉中更高）等问题，都增加了变异解释的复杂性 。目前，对于如何向个体和家庭报告这些 mtDNA 次要发现，也没有既定指南。
研究目的与方法
研究旨在通过评估基因型和表型数据发现 mtDNA 疾病，利用开发的工作流程在 Solve - RD 项目中进行分析。Solve - RD 是欧洲资助的研究项目，旨在为通过欧洲参考网络（ERNs）招募的表型特征明确的罕见病个体建立分子遗传学诊断 。研究使用 MToolBox 开发了半自动化生物信息学流程，对 mtDNA 进行分析。首先，用 42 例先前诊断为 mtDNA 变异个体的外显子组数据集验证该流程，之后在未解决的 Solve - RD 队列中筛选罕见 mtDNA 变异 。变异筛选基于血液异质性水平（≥1%）和已报道的疾病关联性，并过滤掉单倍群标记。
为确定表型相似性评分阈值，研究在由核基因和 mtDNA 疾病组成的 “表型测试队列” 中进行基于 MitoPhen 的表型相似性评分方法测试，该队列包括 47 例先前诊断为 mtDNA 疾病的个体和 1460 例诊断为核基因疾病的个体 。使用 OntologyX 进行表型相似性评估，并用 pROC R 包进行受试者工作特征（ROC）分析，以评估表型相似性在区分诊断类型方面的 discriminatory 性能 。同时，根据 ACMG 标准对候选 mtDNA 变异进行评估，并与线粒体疾病专家和临床遗传学家讨论，优先考虑变异。
研究结果
在 42 例预解决个体中，成功识别出致病变异，异质性水平为 33 - 100%，表型相似性评分＞0.3，且异质性水平在不同检测方法中一致 。基于此，设定了 mtDNA 分析的质量阈值，即至少 50% 的 mtDNA 组装和至少 5× 覆盖 。在未解决队列的 11305 个数据集中，10157 个（90%）符合质量纳入标准 。经过 MToolBox 生物信息学流程和手动筛选，确定了 135 例个体的 136 个变异进行进一步临床评估 。
表型相似性分析显示，mtDNA 疾病个体的平均表型相似性得分高于核基因疾病个体（p＜0.0001） 。通过 Youden 指数确定，表型相似性评分 0.48 时，预测 mtDNA 疾病的敏感性为 94%，特异性为 65%；评分 0.5 时，敏感性为 74%，特异性为 71%；评分 0.3 时，敏感性为 100%，但特异性仅 15% 。ROC 分析生成的曲线下面积（AUC）为 0.82（95% 置信区间 [CI]：0.76 - 0.88），表明表型相似性评分在区分 mtDNA 疾病和核基因疾病个体方面具有良好的 discriminatory 能力 。
在 135 例未诊断个体中，34/37（92%）确诊或可能致病的个体表型相似性评分＞0.3 。大多数确诊个体是通过 ERN - RND 招募的，且所有致病和可能致病的变异在血液中的异质性水平＞11% 。总体而言，在 9483 个家庭的 9923 名受影响个体中，mtDNA 疾病的诊断率为 0.4%，共 37 例新确诊和可能确诊病例 。
此外，研究还发现了 26 个未包含在 MitoPhen 数据库中的罕见意义未明变异（VUSs）。根据 ACMG 指南对这些变异的致病性进行研究，部分变异虽有文献报道与线粒体疾病可能相关，但之前数据不够严格未被纳入 MitoPhen 数据库 。其中，6 个变异具有高表型相似性评分（≥0.5），2 个支持遗传诊断，但 ACMG 标准未达到可能致病状态 。
研究讨论
本研究应用的半自动化工作流程，通过新的基于 HPO 的表型相似性评分方法，对 ES 和 GS 数据进行大规模重新分析，有助于检测致病性 mtDNA 变异 。尽管该研究队列中 mtDNA 疾病的诊断率为 0.4%，低于英国 100K 基因组项目中疑似线粒体疾病的诊断率（2%），但本研究队列不太具有选择性，表型更异质，这与 Genomics Research to Elucidate the Genetics of Rare Diseases Consortium（GREGoR）的类似队列诊断率相符 。
使用不专门针对 mtDNA 的 NGS 数据时，存在线粒体基因组覆盖深度不足和核线粒体 DNA 片段（NUMTs）共扩增的问题 。MToolBox 流程虽能过滤 NUMTs 以减少假阳性变异，但仍建议对候选变异使用替代方法进行额外验证 。本研究中，96% 的样本属于欧亚 mtDNA 谱系，主要为欧洲遗传血统，因此需要在地理和种族多样化的数据集中进一步验证该流程的适用性 。mtDNA 单倍群分析有助于排除 43 个致病性证据冲突的变异，建议在 mtDNA 分析的生物信息学流程中纳入该步骤 。
基于表型相似性阈值的表型驱动方法，能在 ES 和 GS 数据集中检测到先前确认的致病性 mtDNA 变异，并在大型未解决队列中实现新诊断 。表型相似性阈值在变异优先级排序中有用，评分＞0.3 的个体中确诊或可能致病的变异占比高 。然而，HPO 术语有限或不特异的参与者不太可能获得诊断，这限制了基于表型方法的效用 。所有致病和可能致病的变异在血液中的异质性均＞11%，但对于血液异质性较低的个体，在没有其他组织异质性或家族分离信息时，难以确诊 。
研究结论
本研究展示了一种在 ES 或 GS 数据集中检测相关 mtDNA 变异的有效策略。利用 HPO 数据促进了 Solve - RD 项目中 mtDNA 疾病的诊断和优先级排序，即便线粒体疾病并非首要怀疑诊断 。结合相似性评分阈值的结构化表型评估可能会提高新诊断的产出，是分析大型罕见病队列的有用筛选方法 。但对于低异质性或罕见 mtDNA 变异且 HPO 数据有限的个体，需要多学科讨论，专家临床团队的反馈对支持诊断至关重要 。
