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在细胞免疫和聚糖结构调控中，信号肽肽酶样（SPPL）蛋白酶作用关键，但底物识别机制不明。研究人员聚焦 SPPL2 亚家族 N 端蛋白酶相关（PA）结构域展开研究，发现其参与底物识别，影响 TNFα 切割。该研究为理解同源蛋白酶差异奠定基础。
在生命的微观世界里，细胞的各种活动精细而复杂，其中免疫细胞的分化以及细胞表面聚糖结构的调控，对维持机体正常功能至关重要。信号肽肽酶样（SPPL）蛋白酶作为一类特殊的蛋白酶，在这两个关键过程中扮演着重要角色。它属于膜内天冬氨酰蛋白酶家族，能水解 II 型膜蛋白跨膜（TM）结构域内的肽键。然而，目前科学家们对这类蛋白酶识别底物的机制却知之甚少，就像在黑暗中摸索，找不到那关键的 “开关”。究竟是蛋白酶的哪些结构域在底物识别中发挥作用？不同的 SPPL 蛋白酶对相同底物的切割方式为何存在差异？这些问题亟待解决，也促使科研人员踏上探索之旅。
德国奥格斯堡大学的研究人员勇挑重担，针对这些问题展开了深入研究。他们将目光聚焦于 SPPL2 亚家族蛋白酶的 N 端蛋白酶相关（PA）结构域，以肿瘤坏死因子 α（TNFα）为模型底物，深入探究 PA 结构域在底物识别和切割过程中的作用。经过一系列严谨的实验，研究人员得出了令人瞩目的结论。他们发现，SPPL2 亚家族的 N 端 PA 结构域参与了底物识别，并且能够区分在腔 / 细胞外结构域略有差异的底物。例如，SPPL2c 的 PA 结构域会损害 SPPL2a/b 对 TNFα 的初始切割、动力学和连续性；而 SPPL2a 的 PA 结构域则能增强 SPPL2b 对 TNFα 的加工。此外，研究还揭示了 SPPL3 对全长 TNFα 具有非经典脱落活性，且不同 SPPL 家族成员连续切割的能力不同，主要取决于 SPPL2a/b 的跨膜主体。这一研究成果发表在《Communications Biology》上，为深入理解这些同源蛋白酶的机制差异提供了重要依据，犹如在黑暗中点亮了一盏明灯，照亮了后续研究的道路。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们借助 AlphaFold 预测的 3D 结构进行保守性分析，以此探究 PA 结构域的潜在功能；通过构建稳定表达野生型和嵌合蛋白酶的细胞系，研究不同蛋白酶对 TNFα 的加工能力；利用蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术，监测 TNFα 的切割产物；运用质谱分析（MALDI - TOF mass spectrometry）确定切割位点；还采用免疫荧光染色和共聚焦显微镜技术，分析蛋白酶的亚细胞定位。
下面来详细看看研究结果。首先，对 SPPL2 PA 结构域的表面进行保守性分析。研究人员通过 Clustal Omega 对蛋白质序列进行比对，再根据 AlphaFold 预测的 3D 结构对残基进行着色，以此观察不同物种间 PA 结构域表面的保守性。结果发现，人 SPPL2a、SPPL2b 和 SPPL2c 之间不存在高度保守的区域，但在跨物种比较中，各亚型表面出现了高度保守的区域。在人 SPPL2a 和 SPPL2b 之间，也发现了一定程度的保守性，这暗示 PA 结构域可能在亚型特异性蛋白质 - 蛋白质相互作用中发挥作用。
接着是 SPPL N 端结构域对细胞内 TNFα 加工的影响。研究人员在缺乏内源性 SPPL2a 和 SPPL2b 表达的 T - Rex? HEK293 细胞（dKO 细胞）中，稳定表达野生型 SPPL2a、SPPL2b 以及嵌合蛋白酶，并瞬时共表达 TNFα。通过 Western Blot 监测 TNFα 的切割产物发现，TNFα NTF（TNFα 的 N 端片段，是 SPPL2a 和 SPPL2b 的直接底物）的减少与蛋白酶表达成正比。同时，不同的 N 端结构域对 TNFα 加工影响各异，如用 SPPL2c 或 SPPL3 的 N 端结构域替换 SPPL2a 的 N 端结构域，会显著降低 TNFα NTF 的切割效率；而将 SPPL2a 的 PA 结构域融合到 SPPL2b 上，则会提高 SPPL2b 对 TNFα NTF 的切割效率。
在体外实验中，研究人员利用建立的体外检测方法，进一步探究 SPPL2b 嵌合体对 TNFα 切割的能力。实验结果与细胞内实验相互印证，SPPL2a 的 PA 结构域能提高 TNFα NTF 的加工效率，而 SPPL2c 的 PA 结构域则会显著降低 SPPL2a 和 SPPL2b 对 TNFα NTF 的加工活性。
研究人员还关注到 SPPL N 端结构域对 TNFα NTF 加工动力学的影响。他们采用基于膜的切割检测方法，监测 TNFα NTF 随时间的转化。结果显示，SPPL2a 的初始 TNFα 切割动力学在野生型 PA 结构域或 SPPL3 短 N 端存在时最为高效；而 SPPL2c 的 PA 结构域会显著降低 SPPL2a 和 SPPL2b 介导的 TNFα NTF 周转速度。
为了确定嵌合 SPPL2 蛋白酶是否会改变 TNFα 跨膜结构域内的切割位点，研究人员进行了 MALDI - TOF 质谱分析。结果表明，无论表达野生型还是嵌合蛋白酶，都能检测到已知的 SPPL2a 和 SPPL2b 对 TNFα 的主要切割产物，说明嵌合蛋白酶不影响 TNFα 切割的精确性，但会影响切割产物的比例，进而反映出切割过程的连续性变化。
此外，研究还发现 SPPL3 能作为非经典脱落酶切割全长 TNFα，产生可溶性的 sTNFα L3 片段。同时，含有 SPPL3 N 端结构域的嵌合蛋白酶对 SPPL2a 和 SPPL2b 识别 ADAM 生成的 TNFα NTF 的能力有不同影响，这表明 SPPL 蛋白酶的 N 端结构域在识别不同来源的 TNFα 底物时具有特异性。
综合上述研究，研究人员得出结论：SPPL 蛋白酶的 N 端结构域，尤其是 SPPL2 亚家族的 PA 结构域，在底物识别中发挥着重要作用，而酶的连续性切割主要由其跨膜部分决定。然而，目前的研究只是初步探索，酶与底物之间复杂的相互作用机制尚未完全明晰。不同底物与酶的相互作用可能存在差异，未来还需要分析更多的酶 - 底物组合，确定底物与酶结合的实验性 3D 结构，从而更全面、深入地理解这些重要蛋白酶的作用机制。这项研究为后续探索 SPPL 蛋白酶的功能和作用机制提供了重要的基础，有望推动相关领域的进一步发展，为生命科学和健康医学研究开辟新的道路。
