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该研究聚焦法医学领域，针对基于微生物组分析进行体液鉴定缺乏标准化流程的问题，对比 OTUs 和 ASVs，构建异质性训练数据集训练随机森林分类器（RFC），在复杂样本测试中取得良好效果，为微生物组分析用于法医实践提供关键依据。
引言
新一代测序技术的进步推动了人类微生物组在多领域的研究，包括法医学。人体不同部位的微生物群落具有特异性，这为犯罪现场生物证据的体液鉴定（BFI）和身份识别（ID）带来新契机。研究发现，细菌群落存在部位特异性，菌株存在个体特异性，利用这一特性分析犯罪现场生物证据，如确定性侵犯案件中阴道液或精液的存在，对案件调查意义重大。
以往研究探索了细菌群落序列数据用于体液鉴定的潜力，通常针对原核生物 16S rRNA 基因特定区域描述微生物群落，该方法成本效益高，适用于法医样本分析。同时，研究还尝试用机器学习算法将测序结果呈现为预测概率。然而，微生物组分析尚未用于常规法医分析，主要存在缺乏标准化实验室和生物信息学工作流程、分析结果在概率框架下呈现存在知识缺口、机器学习输出作为法庭证据需进一步标准化等问题。
本研究首先对比了操作分类单元（OTUs）和扩增子测序变体（ASVs）用于体液鉴定的分辨率，选择 OTUs 并结合多个数据集生成异质性训练数据集，训练随机森林分类器（RFC），最后用模拟法医样本测试该分类器性能。
结果
- OTUs 和 ASVs 的聚类模式相似：对比唾液、精液等样本的 OTUs 和 ASVs 聚类模式，使用加权 Unifrac（UF）和 Bray Curtis（BC）距离生成主坐标分析（PCoA）图。结果显示，样本均按身体部位聚类，OTUs 和 ASVs 的聚类模式相似，且 OTU 分析的前两个主坐标轴解释的方差比例略高于 ASV 分析，二者坐标间相关性强，表明它们在区分身体部位上效果相当。
- 不同 16S rRNA 基因区域样本聚类相似：采用封闭参考聚类法对不同 16S rRNA 基因区域（V1V3、V3V4、V4V5）的 OTUs 进行聚类分析。结果表明，不同基因区域样本的聚类模式高度相似，基因区域对聚类模式影响不显著，将不同区域数据合并后，体液 / 组织的聚类模式保持一致，说明合并不同 16S rRNA 基因区域数据不影响体液 / 组织的聚类。
- 随机森林分类器预测准确性高：整合九项研究的读取数据，构建包含 457 个样本、6455 个 OTUs 的异质性训练数据集，涉及六种体液 / 组织。训练 RFC 并进行 80 - 20 的训练 - 测试分割，经递归特征消除筛选 281 个 OTUs 用于模型训练。测试集结果显示，加权平均 F1 分数达 0.89，但各分类的 F1 分数有差异，部分样本预测概率低或存在多个相似概率的类别。设置概率阈值后，虽正确分类和错误分类样本比例降低，但引入了未分类样本类别，能更好处理低细菌生物量和近端身体部位样本的不确定性。
- 单源和混合样本预测效果良好：用扩展分类器对 47 个独立盲法单源样本测试，F1 分数较高，多数样本能正确分类，虽有部分样本因低微生物生物量和近端部位问题未分类，但无错误分类情况。对 104 个实验室生成的混合源样本测试发现，多数样本能可靠识别至少一种混合物成分，尤其是微生物负载高的成分。
- 分类器在法医样本检测中表现出色：对 10 名女性的内衣样本测试，分类器能检测出阴道 / 月经液的微生物分类群，还发现精液和手部皮肤的少量特征。对 22 对异性恋夫妇的性共享微生物组（sexome）样本分析，能检测到性活动后男女成分的混合，预测概率可推断性活动时间和性质，如性行为后 4 天内可检测到口腔痕迹，这对法医案件分析具有重要意义。
- 信息分类群分析解释预测结果：通过随机森林分类器的特征重要性分数评估信息分类群，选取每个训练类别的前 10 个信息分类群，共 45 个 OTUs。不同体液 / 组织的信息分类群各具特征，如唾液中的韦荣氏菌属（Veillonella）和梭杆菌属（Fusobacterium），手部皮肤的棒状杆菌属（Cutibacterium）等。部分重叠的 OTUs 会影响相近部位体液 / 组织的区分，但特征 OTUs 和相对丰度差异仍可实现总体区分，这也解释了研究中部分误分类的原因。
讨论
在生物信息学方面，ASVs 虽能更精确表征微生物多样性和检测稀有分类群，但存在相对丰度计算误差等问题。本研究表明，OTUs 和 ASVs 在法医体液鉴定分辨率上相当，OTU 聚类可整合不同 16S rRNA 基因区域数据。整合不同区域数据的分析显示，样本聚类主要受身体部位驱动，联合数据训练的分类器能有效识别体液分类信息分类群，且在其他应用中也有益处。
在将微生物组预测作为法庭证据方面，本研究训练的 RFC 分类器 F1 分数与以往研究相当或略高，样本大小、微生物多样性等因素影响各分类的 F1 分数和预测概率。评估误分类发现，精液样本分类困难，原因包括低微生物多样性、生物量和近端部位污染等，部分样本缺乏性活动元数据也影响分类准确性。
F1 分数虽能评估分类器性能，但评估每个样本和类别的预测概率很重要。设定阈值可减少单源样本的误判，但混合源样本无法简单应用该方法，可考虑对相关体液 / 组织的累积概率设置阈值，或采用多类分类器、贝叶斯网络等工具。
内衣和 sexome 样本分析显示，分类器能检测样本特征，推断性活动情况，但内衣微生物组的法医适用性需进一步研究。Sexome 样本研究为法医应用提供新视角，虽目前样本量有限，但未来扩大样本队列研究可充分发挥其在法医案件中的潜力，同时也有助于健康相关研究。
微生物组分析在解决混合源样本和推断性活动方面有优势，但低细菌负载的体液 / 组织分类存在挑战。未来可整合多种标记物，如 mRNA、DNA 甲基化、蛋白质和代谢物标记物进行体液 / 组织鉴定，但每种标记物都有优缺点，需深入研究其在法医相关条件下的应用，还可开发综合工作流程实现多标记物平行分析。
结论
本研究明确了生物信息学和评估报告两个关键方面的重要决策，有助于将微生物组分析整合到法医案件工作中。提出用异质性数据集训练 RFC，并对复杂样本进行系统测试，为机器学习在法医学中的应用和 sexome 研究提供了方向，同时指出微生物组分析用于法医体液鉴定需解决的问题。
材料和方法
- 数据集、对照和模拟样本描述：研究整合了九个微生物组数据集，涵盖四项未发表和五项已发表研究，涉及 V1V3、V3V4、V4 和 V4V5 16S rRNA 基因区域，共 788 个样本，来自七种体液 / 组织。
- 已发表研究和 ISALA 项目数据：获取多个已发表研究的 V3V4、V4V5 和 V4 区域读取数据，以及 ISALA 项目的阴道 V4 数据，样本 ID 和 SRA 登录号等信息在元数据文件中。
- 未发表研究数据生成：苏黎世数据集：苏黎世研究所法医实验室生成四个未发表数据集，针对 16S rRNA 基因的 V1V3、V3V4 和 V4V5 区域，部分数据集采用不同协议生成，包含多种样本类型。
- 苏黎世数据集样本采集：2020 - 2023 年招募参与者，按伦理准则获取知情同意。单源样本直接采集或转移到棉签上，制备控制模拟混合物样本，收集非控制模拟样本（内衣和 sexome 样本），并让捐赠者填写问卷，同时设置空白和阴性对照。
- 苏黎世数据集 DNA 提取和定量：使用多种 DNA 提取试剂盒，按修改后的协议操作。DNA 定量采用多种方法，根据 qPCR 的 Ct 值确定扩增子 PCR 循环数。
- 苏黎世数据集文库制备和测序：扩增 16S rRNA 基因的不同区域，优化引物、PCR 协议和循环条件。对 PCR 产物进行纯化、筛选和双索引，量化、归一化和混合文库后进行测序，在 Illumina MiSeq 平台获得不同长度的配对末端读数。
- 所有数据集读取数据处理：用不同方法去除引物，通过 DADA2 管道处理数据，将 ASV 丰度表聚类为 OTUs，去除污染数据，合并 OTU 丰度表，构建系统发育树，进行归一化和多样性分析，在 R 中完成相关操作。
- 所有数据集的随机森林分类器机器学习：选取 457 个单源对照样本和 6455 个 OTUs，基于 RFC 进行机器学习预测。训练时采用 80 - 20 分割，经递归特征提取筛选 OTUs，进行五折交叉验证，计算多种评估指标。还用整个数据集训练另一个 RFC，对盲法单源样本和模拟样本进行预测，并进行信息特征分析。
