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本文研究丝状硫化物氧化菌（Beggiatoa spp.）在磷循环中的作用。经多代磷饥饿培养实验发现，该菌能适应磷变化，在重新引入磷酸盐后快速吸收并储存。这表明其在底栖磷循环中或扮演重要角色，值得关注。
引言
磷（P）是生物体必需的微量营养元素，参与细胞关键生物分子的构成，在水生环境中，其有效性与铁（Fe）相关，受氧化还原条件影响。生物过程如细菌聚磷酸盐（polyP）积累对磷有效性的影响逐渐受到关注，但聚磷菌的重要性仍被低估。
polyP 由多个正磷酸盐单元通过高能磷酸酐键连接而成，原核生物以颗粒形式合成和储存 polyP，它可分解为正磷酸盐或直接用于多种功能，被视为细胞内能量缓冲剂和代谢调节剂。微生物在不同磷酸盐条件下有不同的 polyP 合成机制，包括奢侈摄取、超量摄取和饥饿响应。
大型硫细菌因体积大，大量积累 polyP，显著影响海洋沉积物中的磷通量，如纳米比亚大陆架的Thiomargarita namibiensis与磷块岩形成有关。丝状大型硫细菌Beggiatoa sp. 35Flor 菌株在实验室和部分海洋环境中被观察到会引起磷酸盐释放。尽管其分布广泛，但在磷循环中的作用研究不足，尤其是在未形成明显白色菌垫的环境中。本研究旨在探究磷饥饿的Beggiatoa spp. 对过量磷酸盐的响应，评估其菌垫调节养分脉冲的能力，具体研究两个问题：一是缺磷如何影响Beggiatoa spp. 培养物的世代繁殖；二是重新引入磷后，超量磷酸盐摄取和后续奢侈性 polyP 形成的动态变化。
材料和方法
实验选用 2002 年培养的丝状海洋硫化物氧化菌Beggiatoa sp. 35Flor 菌株，最初从佛罗里达海岸石珊瑚黑带病富集微生物群落的单根丝状体中分离得到。该菌株为化能自养菌，丝状体厚度 6μm，有明显的 polyP 和硫内含物，培养时需伴生的异养且代谢多样的Pseudovibrio sp. strain FO - BEG1。
实验采用双层矿物半液体琼脂培养基，通过控制硫化物和氧的反向梯度进行培养。获取磷耗尽培养物时，用无额外磷源的改良培养基培养细菌，琼脂需多次清洗以减少磷污染，顶层琼脂浓度降至 0.2%，底层琼脂提供 4mmol/L 硫化物。经五代培养，大部分丝状体中检测不到 polyP 内含物。每代在室温（20 - 21°C）黑暗条件下培养 6 天，转移子样本接种到新培养基中，计算每代菌垫形成率。
在第五代磷饥饿培养物生长 6 天后进行磷酸盐孵育实验，向菌垫中直接注入 100μL 0.5mmol/L KH?PO?人工海水溶液。在添加磷后不同时间点（0、10min、30min、2h、24h）收集样本，包括磷饥饿菌垫（时间 0）、无磷补充的无菌培养基空白样本和添加磷后的无菌培养基空白样本。每次收集六个培养管的整个菌垫，合并为一个混合样本，用于分析总磷、蛋白质含量、总溶解磷、溶解无机磷酸盐和显微镜观察的丝状体。实验重复五次，还进行了短期孵育实验观察磷酸盐掺入 polyP 池的速度。
总磷和总溶解磷采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP - OES）测定，蛋白质含量用 Bradford 法，以牛血清白蛋白为标准，溶解无机磷酸盐用标准比色法。polyP 通过用 4′,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色，在荧光显微镜下观察。通过计数含 polyP 的丝状体占总观察丝状体的比例，确定含 polyP 丝状体的比例。
使用 R 软件进行数据可视化和统计分析。用非参数 Kruskal - Wallis 检验比较各代菌垫形成率的中位数，用 Dunn’s 检验和 Benjamini - Hochberg（BH）方法进行多重比较。计算磷酸盐摄取率，并采用指数衰减模型描述磷酸盐浓度随时间的变化，用渐近回归拟合颗粒磷浓度随时间的变化。
结果
随着磷饥饿代数增加，菌垫形成率下降。第三代菌垫形成率中位数显著降低至 0.75，与第一代和第二代相比差异明显；到第五代，菌垫形成率进一步降至 0.46，但第三代到第五代之间无显著变化。
荧光显微镜观察显示，第五代磷饥饿培养物在添加磷前，83% 的丝状体无可见 polyP 内含物。添加磷后，含 polyP 的丝状体数量迅速增加，30min 时达到 86%，24h 后增至 93%。polyP 的分布和形态也发生变化，从 30min 时的小颗粒逐渐变为 24h 时在细胞中央大液泡中储存，直径可达 5μm。
在磷酸盐孵育实验开始时，培养基中背景磷酸盐浓度较低，添加 KH?PO?后，初始平均磷酸盐浓度为 39μmol/L。实验过程中，0 - 10min 内磷酸盐摄取速率极高，随后逐渐下降。磷酸盐浓度随时间呈指数下降，24h 后降至平均 1.78μmol/L，而颗粒磷浓度则逐渐上升，符合渐近回归模型。
讨论
磷饥饿导致Beggiatoa sp. 菌垫形成率下降，可能原因是磷饥饿间接影响了细菌聚集形成菌垫的能力。一方面，磷饥饿可能使细菌为获取磷而突破典型的趋化反应范围，导致电子供体和受体不匹配，无法产生足够能量，同时进入氧化层的细胞因缺乏过氧化氢酶而难以抵御氧化应激死亡；另一方面，polyP 作为能量来源缺失可能降低丝状体的滑动速度，使其难以找到合适的生长位置。
尽管处于长期磷饥饿状态，Beggiatoa sp. 35Flor 仍能生长五代，且第五代中约 17% 的丝状体含有 polyP 内含物。这表明 polyP 不仅是无机磷酸盐的储存库，还可能在关键生存机制相关的代谢过程中起重要作用，与压力反应相关，其缺失可能抑制代谢生存机制，降低菌垫形成成功率。
Beggiatoa sp. 35Flor 在重新添加磷后，初始 10min 内磷酸盐摄取速率极快，比典型细菌如Acinetobacter spp. 高得多，与类似大小的丝状细菌Oscillatoria agardhii相比也有显著差异。这种差异可能与细胞体积、磷饥饿时间、实验设计中的低磷浓度以及细菌生理和基因组成不同有关。快速摄取磷酸盐符合饥饿细菌的超量响应，且 polyP 在添加磷 2min 后就开始出现，可能是为防止短链 polyP 潜在毒性的安全机制。
虽然无法直接测量 polyP，但实验证据支持磷酸盐以 polyP 形式储存的假设。通过计算和假设，估算出自然环境中Beggiatoa spp. 的平均磷酸盐摄取量为 0.6 - 6mmol/m2/d，与纳米比亚沉积物中大型硫细菌的磷酸盐摄取率处于同一数量级。Beggiatoa spp. 在不同氧化还原条件下对磷循环的作用不同，在有氧低硫化物通量条件下，可能作为临时磷汇；在硫化物和缺氧条件下，则会分解 polyP 释放磷酸盐，成为磷源。这种变化受氧化还原条件的时间变化影响，如波罗的海沉积物的季节性波动。
总之，Beggiatoa sp. strain 35Flor 能耐受长期磷消耗，可能得益于 polyP 储存，其在磷饥饿条件下对菌垫形成至关重要。该菌在重新引入磷后表现出独特的快速超量磷酸盐摄取能力。尽管还需更多环境样本研究来确认其在调节沉积物 - 水界面磷酸盐通量中的作用，但研究结果表明，在有氧条件下，Beggiatoa菌垫有潜力成为重要的磷汇。
致谢
研究得到 Christin Laudan 在培养和实验室支持方面的帮助，感谢波罗的海 TRANSCOAST 研究培训小组的支持和建议，以及 Simeon Choo 在磷酸盐测量方面的讨论和 Jan Henkel 对手稿的反馈。本研究由德国研究基金会（DFG）资助，是波罗的海 TRANSCOAST 出版物 GRK2000/0076。
