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本文聚焦铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），探究转录调节因子 FleQ 在生物被膜抗生素耐受性中的作用。研究发现 FleQ 与 SagS 协同，通过精细调控 BrlR 激活基因的表达，影响生物被膜的形成和对抗生素的耐受性，为攻克相关感染难题提供新方向。
铜绿假单胞菌生物被膜与 FleQ 的研究背景
生物被膜是细菌在表面生长形成的群落，由自身产生的胞外多糖基质包裹。铜绿假单胞菌的生物被膜与多种感染性疾病相关，如医院获得性肺炎、烧伤伤口感染等，且对多种抗菌药物具有高度耐受性，给治疗带来极大挑战。
在铜绿假单胞菌从浮游态转变为生物被膜生长模式的过程中，涉及众多调控系统。其中，c-di-GMP 作为关键的细菌第二信使，对生物被膜的形成、细菌的运动性、表面附着及毒力等细胞功能起着重要调节作用 。SagS 和 FleQ 也是参与这一转变过程的重要调节因子。
SagS 是一种传感器 - 调节因子杂交蛋白，与 Gac/Rsm 信号通路和 c-di-GMP 调节相关。它通过两种不同途径促进生物被膜的发育和激活生物被膜相关的抗菌耐受性：一方面，通过磷酸信号传递到 BfiSR 双组分调节系统（TCS），调节小调节 RNA（sRNA）水平，促进浮游态到生物被膜生长模式的转变；另一方面，通过调节 c-di-GMP 水平，间接激活 BrlR，使细菌从对抗菌药物敏感状态转变为高度耐受状态 。
FleQ 是一种转录调节因子，它依赖 c-di-GMP 水平反向调节编码鞭毛和胞外多糖的基因表达。当细胞内 c-di-GMP 水平较高时，FleQ 激活与生物被膜形成相关的基因，同时抑制与运动性相关的基因表达 。然而，FleQ 在铜绿假单胞菌生物被膜抗生素耐受性方面的作用此前尚不明确。
FleQ 对铜绿假单胞菌生物被膜结构的影响
研究人员为深入探究 FleQ 在形成抗生素耐受性生物被膜中的作用，首先对铜绿假单胞菌 ΔfleQ突变株在流动条件下形成生物被膜的能力进行评估。在连续流动培养 6 天后，对生物被膜结构进行可视化分析，结果显示 ΔfleQ突变株形成的是无结构、平坦的表面相关细菌群落，而野生型 PAO1 形成的生物被膜则具有大型微菌落。COMSTAT 分析进一步证实了两者在生物被膜生物量积累和高度上存在显著差异。此外，多拷贝表达fleQ能够使 ΔfleQ突变株的生物被膜形成恢复到野生型水平。同时，研究发现 PAO1 和 ΔfleQ在浮游生长条件下的生长行为相似，这表明生物被膜结构的差异并非由生长速率不同导致。由此可见，FleQ 在铜绿假单胞菌生物被膜结构的形成中发挥着关键作用。
FleQ 对铜绿假单胞菌生物被膜抗生素耐受性的影响
为评估 ΔfleQ突变株形成的生物被膜对抗生素的敏感性，研究人员在流动条件下，将野生型和突变株的表面附着细胞暴露于 150 μg/mL 的妥布霉素中 1 小时。结果显示，野生型 PAO1 细胞形成的生物被膜在暴露于妥布霉素后，存活率下降小于 1 log，而 ΔfleQ生物被膜细胞的存活率下降超过 2.2 logs。多拷贝表达fleQ可使 ΔfleQ生物被膜细胞对妥布霉素的敏感性恢复到野生型水平。
考虑到此前研究表明生物被膜基质成分对带正电荷的抗生素（如妥布霉素）具有保护作用，而 FleQ 参与调节生物被膜基质中 Pel 和 Psl 胞外多糖的表达，研究人员进一步探究 ΔfleQ生物被膜对抗生素敏感性的增加是否仅针对带正电荷的抗生素。实验结果表明，ΔfleQ生物被膜对中性氟喹诺酮类抗生素诺氟沙星也更为敏感，且多拷贝表达fleQ同样能使 ΔfleQ生物被膜细胞对诺氟沙星的敏感性恢复到野生型水平，这说明 ΔfleQ生物被膜对抗生素敏感性增加的表型与胞外多糖的丰度无关。
研究人员还通过生物被膜最低杀菌浓度（MBC）测定法，进一步确定 FleQ 是否影响生物被膜细胞的抗杀伤能力。实验中，将铜绿假单胞菌野生型和 ΔfleQ细胞培养 3 天形成生物被膜后，更换为含有 300 μg/mL 妥布霉素的培养基继续培养 24 小时。结果显示，野生型 PAO1 生物被膜细胞未被完全清除，而 ΔsagS生物被膜中未检测到存活细胞，ΔfleQ生物被膜在经过 24 小时妥布霉素处理后同样未检测到存活细胞，这表明 FleQ 的失活对生物被膜抗杀伤能力的影响与sagS类似。综合以上实验结果，FleQ 在铜绿假单胞菌生物被膜的抗生素耐受性中发挥着重要作用。
FleQ 与 SagS 在生物被膜形成中的关系
由于 ΔfleQ和 ΔsagS生物被膜在结构和抗生素敏感性表型上具有相似性，研究人员推测 FleQ 和 SagS 可能协同或共同作用影响生物被膜的形成。此前研究表明，多拷贝表达某些位于 SagS 下游的基因（如bfiR和brlR），能够使 ΔsagS生物被膜的表型恢复到野生型水平 。基于此，研究人员通过类似的上位性分析来评估 SagS 和 FleQ 之间的功能关系。
实验结果显示，虽然多拷贝表达fleQ能够使 ΔfleQ生物被膜的形成恢复到野生型水平，但多拷贝表达sagS却无法挽救或增强 ΔfleQ生物被膜的形成；同样，在 ΔsagS中多拷贝表达fleQ也无法挽救或增强该突变株生物被膜的形成。此外，研究人员还评估了双突变株 ΔfleQΔsagS生物被膜的形成情况。结果显示，ΔfleQ和 ΔfleQΔsagS双突变株形成的生物被膜生物量均明显低于野生型 PAO1，且 ΔfleQΔsagS双突变株的生物被膜生物量似乎比 ΔfleQ更少，尽管 COMSTAT 分析显示两者差异不显著，但这些结果暗示 FleQ 和 SagS 可能通过不同但协同的调节途径促进生物被膜的形成。
为进一步探究 FleQ 和 SagS 在生物被膜形成中的协同作用，研究人员分析了fleQ和sagS突变株生物被膜中关键特征（如 c-di-GMP 水平）的差异。已知 SagS 通过调节 c-di-GMP 水平影响生物被膜的形成，ΔsagS生物被膜细胞的 c-di-GMP 水平相对于 PAO1 生物被膜细胞显著降低，且多拷贝表达编码二鸟苷酸环化酶 GcbA 的gcbA基因，能够使 ΔsagS生物被膜的形成恢复到野生型水平 。实验结果显示，ΔsagS生物被膜细胞的 c-di-GMP 水平确实显著低于 PAO1 生物被膜细胞，而 ΔfleQ生物被膜的 c-di-GMP 水平则高于野生型生物被膜。同时，多拷贝表达gcbA能够恢复 ΔsagS生物被膜的形成，但对 ΔfleQ生物被膜的结构没有影响；多拷贝表达编码 BfiSR 双组分调节系统中响应调节因子的bfiR基因，能使 ΔsagS生物被膜的形成恢复到野生型水平，但对 ΔfleQ生物被膜的形成也没有明显影响。这些结果强烈表明，FleQ 和 SagS 通过不同但相互协作的机制促进生物被膜的形成。
FleQ 与 SagS 在生物被膜抗生素耐受性中的协同作用
鉴于 ΔfleQ生物被膜对妥布霉素和诺氟沙星的敏感性表型与 ΔsagS和 ΔPA1876 突变株生物被膜相似，研究人员推测 FleQ 和 SagS 在铜绿假单胞菌生物被膜的抗生素耐受性中均发挥作用。为确定 FleQ 和 SagS 对生物被膜药物耐受性的贡献是否相同，研究人员进行了上位性分析和生物被膜对抗生素敏感性的测定。
实验结果显示，在 ΔfleQ中多拷贝表达sagS无法使生物被膜对妥布霉素的敏感性恢复到野生型水平，ΔfleQ/pMJT-sagS生物被膜细胞在暴露于妥布霉素 1 小时后，CFU（菌落形成单位）减少超过 2.5 logs；同样，在 ΔsagS细胞中过表达fleQ也无法挽救生物被膜的敏感性表型。此外，双突变株 ΔfleQΔsagS对妥布霉素的敏感性显著高于野生型生物被膜，且与 ΔfleQ和 ΔsagS单突变株生物被膜的敏感性相当，这强烈表明 FleQ 和 SagS 在一定程度上协同作用，共同影响生物被膜的抗生素耐受性。
FleQ 对 BrlR 丰度和 DNA 结合能力的影响
SagS 通过间接激活转录调节因子 BrlR，促使细菌从对抗菌药物敏感状态转变为高度耐受状态 。BrlR 激活编码多药外排（MDR）泵和 ABC 转运体的基因表达，使细菌对包括妥布霉素和诺氟沙星在内的五类抗生素产生耐受性 。由于 ΔsagS生物被膜的特征是缺乏或显著降低活性 BrlR 的丰度，研究人员首先探究 ΔfleQ生物被膜对抗生素敏感性增加的表型是否是由于 BrlR 丰度降低或存在无功能的 BrlR。
免疫印迹分析结果显示，ΔfleQ生物被膜细胞中 BrlR 的丰度与 PAO1 相比，即便没有增加，也至少相似。此外，通过链霉亲和素下拉实验和生物素化的 PbrlR检测发现，ΔfleQ生物被膜细胞产生的 BrlR 与野生型生物被膜中获得的 BrlR 类似，能够与brlR启动子 DNA 结合，且能被非生物素化的竞争 DNA（PbrlR - NB）所竞争，从而阻断其结合。这表明 FleQ 的失活并不影响 BrlR 的丰度和 DNA 结合能力。
FleQ 对 BrlR 调控基因表达的精细调节
尽管 ΔfleQ突变株生物被膜中 BrlR 丰度正常且具有 DNA 结合能力，但该突变株生物被膜却对妥布霉素和诺氟沙星敏感。为探究其中原因，研究人员通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）评估 BrlR 下游靶基因的表达情况，以确定 FleQ 是否影响 BrlR 的功能。研究人员检测的靶基因包括编码 Mex 外排泵的基因（mexA、mexC）、ABC 转运体 PA1874 - 77 以及与粘菌素抗性相关的基因（pmrA、phoP、arnC）。
实验结果显示，与野生型生物被膜相比，fleQ的失活或多拷贝表达对 BrlR 靶基因mexA以及与粘菌素抗性相关的基因（pmrA、phoP、arnC）的转录丰度影响较小。然而，在 ΔfleQ或过表达fleQ的生物被膜中，BrlR 靶基因 PA1874 和mexC的转录丰度与野生型生物被膜相比存在显著差异。这表明 FleQ 能够精细调节 BrlR 调控的部分基因表达，这些基因此前已被证明与生物被膜的抗生素耐受性相关。
为确定 FleQ 是否直接影响mexC和 PA1874 的表达，研究人员检测了 FleQ 与 PA1874 - 77 和mexCD - oprJ操纵子启动子的结合能力，并以 FleQ 与pel启动子的结合作为对照。结果显示，FleQ 能够结合pel启动子，但无论是在有无 c-di-GMP 的情况下，均未检测到 FleQ 与 PA1874 - 77 和mexCD - oprJ启动子区域的结合。此外，在 PA1874 - 77 和mexCD - oprJ启动子区域也未发现可能的 FleQ 结合位点，这排除了 FleQ 与 PA1874 - 77 和mexCD - oprJ之间存在直接联系的可能性。
FleQ 与 SagS 的相互作用
上述研究结果表明，FleQ 不影响brlR的表达或 BrlR 的 DNA 结合能力，但间接精细调节 BrlR 调控的基因 PA1874 - 77 和mexCD - oprJ的表达。考虑到 SagS 作为调节枢纽，连接多个信号系统间接调节brlR表达以实现生物被膜的药物耐受性，研究人员推测 FleQ 可能与 SagS 相互作用。
为验证这一推测，研究人员利用免疫共沉淀实验进行检测。结果显示，当以 HA 标记的 SagS 作为诱饵蛋白时，全长 FleQ 能够与 SagS 共纯化，而在对照中未检测到 FleQ，这证实了 FleQ 与 SagS 之间相互作用的特异性；当以 V5 标记的 FleQ 作为诱饵时，同样检测到了 SagS，进一步确认了两者的相互作用。
此前研究表明，SagS 的功能依赖于其模块化组成，其中细胞质 HisKA - Rec 结构域对其功能至关重要 。因此，研究人员利用基于细菌腺苷酸环化酶的双杂交（BACTH）实验，在大肠杆菌中探究 FleQ 是否通过 SagS 的一个或两个细胞质结构域与之相互作用。实验中，将全长 FleQ 和截短的 SagS 结构域构建体（仅包含 SagS 的 HisKA - Rec、HisKA 或 Rec 结构域）分别与腺苷酸环化酶的 T18 或 T25 亚基融合，然后在大肠杆菌 DHM1 菌株中共表达以检测相互作用。结果显示，FleQ 与包含 HisKA 和 Rec 结构域的 SagS 构建体之间存在明显的相互作用，而与仅包含 HisKA 或 Rec 结构域的 SagS 构建体之间几乎没有相互作用。通过 Miller 实验对蛋白质 - 蛋白质相互作用进行定量分析，进一步证实了 FleQ 主要通过其 HisKA - Rec 结构域与 SagS 相互作用。
研究总结与展望
本研究深入探讨了 FleQ 在铜绿假单胞菌生物被膜抗生素耐受性形成中的作用，以及 FleQ 与其他调节系统的相互关系。研究发现，FleQ 不仅参与生物被膜的形成，还对生物被膜的抗生素耐受性具有重要影响。FleQ 通过与 SagS 相互作用，在 SagS 激活 BrlR 后，精细调节 BrlR 调控的部分基因（如 PA1874 - 77）的表达，从而影响生物被膜的抗生素耐受性。这一研究结果揭示了铜绿假单胞菌生物被膜抗生素耐受性的新机制，为开发针对铜绿假单胞菌感染的新型治疗策略提供了理论依据。
然而，目前仍有一些问题有待进一步研究。例如，FleQ 和 SagS 相互作用的具体分子机制尚不清楚，两者相互作用是否是 FleQ 精细调节基因表达所必需的，以及这种相互作用在不同环境条件下对生物被膜形成和抗生素耐受性的影响等。未来的研究将聚焦于这些问题，以期更深入地理解铜绿假单胞菌生物被膜的形成机制和抗生素耐受性的调控网络，为解决铜绿假单胞菌感染相关的临床问题提供更有效的解决方案。
