创新实时 PCR 检测流程：快速精准诊断毛霉病的新突破

毛霉病死亡率高，早期准确诊断至关重要。本文开发并评估了两种实时 PCR 检测方法，即泛毛霉目（Pan-Mucorales）PCR 和多重实时 PCR。它们能快速检测临床样本中的毛霉目真菌并鉴定菌种，可显著缩短诊断时间、降低成本，助力临床诊疗。

　　

引言

毛霉目（Mucorales）真菌是引发毛霉病（mucormycosis）的病原体，在世界卫生组织真菌优先病原体名单上位居前列。全球范围内，与毛霉病相关的主要毛霉目真菌包括根霉属（Rhizopus）、毛霉属（Mucor）、犁头霉属（Lichtheimia）和根毛霉属（Rhizomucor）等，不同地区其流行情况有所差异。在澳大利亚的一项多中心研究中，根霉属（包含少根根霉（Rhizopus arrhizus）和小孢根霉（Rhizopus microsporus））和毛霉属是主要致病属，180 天死亡率达 56.7%。侵袭性毛霉病的危险因素众多，如未控制的糖尿病、血液系统恶性肿瘤、实体器官移植、使用皮质类固醇、免疫功能正常者的严重创伤，以及近期的 2019 冠状病毒病感染等。近年来，由于积极的免疫抑制治疗、血液系统患者中三唑类抗真菌预防药物的广泛使用，以及控制不佳的糖尿病患病率上升，毛霉病的发病率呈上升趋势。

目前，毛霉病诊断的金标准是在组织病理切片中识别特征性的带状、稀疏分隔、不规则分支的菌丝，并从正常无菌部位培养确认。然而，准确的组织病理学诊断依赖专业知识，且无法进行病原体的物种鉴定。基于培养的方法也面临诸多问题，如菌丝脆弱，在接受抗真菌治疗的患者中敏感性降低，导致诊断常延迟或漏诊，许多病例在死后才被确诊。此外，缺乏批准的毛霉目特异性血清学检测方法，进一步限制了诊断。虽然商业分子检测方法不断涌现，但存在成本高、仅能检测毛霉目而无法进行物种鉴定等问题。因此，开发快速、准确且经济的毛霉病诊断方法迫在眉睫。

材料和方法

1. 真菌分离株和细菌：研究共选取 80 株真菌和 10 株细菌分离株。其中真菌包括少根根霉（11 株）、小孢根霉（12 株）、毛霉属（11 株）等多种毛霉目真菌，以及其他非毛霉目真菌病原体；细菌病原体涵盖金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）等。所有真菌分离株通过核糖体 DNA 内转录间隔区（ITS）测序确认身份，细菌病原体采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定。选择这些 “测试” 病原体是因为它们在临床标本中频繁出现。
2. 临床标本：对 2013 年 11 月至 2024 年 9 月期间作为常规护理标准检测真菌的 166 份存档临床标本进行评估。标本类型多样，包括新鲜组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织、液体、支气管肺泡灌洗液 / 支气管冲洗液（BALF/BW）、脑脊液（CSF）、骨、细针穿刺抽吸物（FNA）等，根据之前的泛真菌 PCR 检测结果，分为已知含或不含毛霉目 DNA 两类。标本按常规实验室方法存储在不同温度下。新开发的两种 PCR 检测结果与真菌培养、组织病理学、泛真菌 PCR 和 DNA 测序结果（若有）进行对比，检测流程遵循特定算法。
3. DNA 提取：真菌培养物的 DNA 提取使用 NucliSens EasyMag（bioMérieux Inc.），按照制造商说明操作；细菌分离株的 DNA 采用煮沸法提取，即两个细菌菌落悬浮于 1mL 无菌水中，100°C 煮沸 10 分钟，随后 1000rpm 离心 5 分钟，取 10μL 上清液用于 PCR 反应。临床样本的 DNA 提取使用 High Pure PCR Template Preparation Kit（Roche Diagnostics），FFPE 组织在提取前需用组织透明剂（histolene）去除石蜡，DNA 提取物保存于 -20°C 或 -70°C。
4. 引物和探针：泛毛霉目 PCR 检测选择针对 18S rDNA 基因的引物和探针，多重属 / 种特异性检测针对少根根霉、小孢根霉和毛霉属，分别选择针对 ITS1 区域和 ITS 区域的引物和探针。所有引物和探针组合通过美国国家生物技术信息中心引物基本局部比对搜索工具（BLAST）评估特异性。检测中的探针标记不同荧光染料，以便在 LightCycler 480 II 仪器（Roche Diagnostics）的不同通道准确检测。两种检测均与人类 β - 珠蛋白（HBG）引物和探针进行多重反应，作为内部对照，用于检测 PCR 抑制、干扰以及验证标本的充分性。每个引物和探针组在纳入与 HBG 的多重检测前，先进行单重检测评估。
5. 实时 PCR：PCR 反应总体积为 25μL。泛毛霉目 PCR 反应体系包含 1× SensiFAST Probe No - ROX Master Mix、特定浓度的引物和探针以及 10μL DNA；毛霉目多重属 / 种特异性 PCR 反应体系类似，但各引物和探针浓度有所不同。PCR 扩增在 LightCycler 480 II 仪器上进行，经过初始变性、循环扩增和最终冷却步骤。阳性结果定义为应用颜色补偿分析后，交叉点（C_p）值 < 40 个循环，且所有 PCR 曲线需手动审核，确保曲线形状和终点荧光符合真阳性结果。实验设置高、低阳性对照和无模板对照，分别使用含不同浓度少根根霉、小孢根霉和毛霉属培养悬液的加标 BALF 和无菌无核酸酶水。
6. 检测限：制备少根根霉、小孢根霉、毛霉属和伞枝犁头霉（Lichtheimia corymbifera）分生孢子的无菌水悬浮液，并调整浓度。通过系列稀释制备不同浓度的加标 BALF，提取 DNA 后进行 PCR 检测，确定检测限，即 PCR 能检测到目标的最低 BALF 浓度。
7. 分析：以泛真菌 PCR 作为当前毛霉目诊断的分子标准，评估每个 PCR 检测的敏感性、特异性、分析阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV），并计算与泛真菌 PCR 结果的总体百分比一致性。需注意，此处计算的 PPV 和 NPV 反映检测的分析性能，而非临床预测值，临床预测值需专门的临床研究确定。

结果

1. 真菌分离株和细菌：泛毛霉目 PCR 检测对 56 株毛霉目真菌分离株、24 株非毛霉目真菌和 10 株细菌病原体检测时，展现出 100% 的敏感性和特异性。毛霉目多重属 / 种特异性 PCR 检测对少根根霉和小孢根霉的敏感性均为 100%，未观察到种间交叉反应；对毛霉属的敏感性为 91%，无法检测到两栖毛霉（Mucor amphibiorum），所有情况下特异性均为 100%，不同物种、属之间以及与非靶向毛霉目物种或其他真菌、细菌之间均无交叉反应。
2. 检测限：泛毛霉目 PCR 检测的检测限约为 10¹CFU/mL，多重靶向 PCR 检测中，少根根霉、小孢根霉和毛霉属的检测限也均为 10¹CFU/mL。
3. 临床标本：166 份临床标本中，2 份 FFPE 组织样本因无效结果被排除，最终 164 份标本纳入分析。泛毛霉目 PCR 检测的敏感性为 98.6%，特异性为 100%，分析阳性预测值和阴性预测值分别为 100% 和 99%，与泛真菌 PCR 结果的一致性达 99.4%。单一假阴性结果出现在一份 2021 年收集的痰标本中，可能是由于在 -70°C 长期保存导致毛霉目 DNA 降解。

68 份毛霉目 DNA 阳性标本进一步进行多重属 / 种特异性 PCR 检测。少根根霉 PCR 检测的临床敏感性为 93.8%，小孢根霉为 70.8%，毛霉属为 75%。假阴性结果多与标本中真菌 DNA 含量低有关，表现为泛毛霉目 PCR 检测中 C_p值 > 30。该检测无法检测到两栖毛霉，但成功检测到所有其他已知对人类致病的毛霉属物种。临床特异性方面，所有三个靶点均为 100%，分析 PPV 均为 100%，NPV 在 86.3% - 98.1% 之间。与泛真菌 PCR 结果的一致性，少根根霉为 98.5%，小孢根霉为 89.7%，毛霉属为 97.1%。68 份标本中有 20 份含有非少根根霉、小孢根霉和毛霉属的毛霉目 DNA，多重检测未检测到这些样本，符合预期。

将 PCR 检测阳性标本的结果与其他诊断方法对比发现，泛毛霉目 PCR 能检测到所有培养或组织学阳性的样本，但由于多数样本缺乏相应培养和组织学数据，难以全面评估。排除多重 PCR 未靶向的毛霉目真菌样本后，靶向检测能检测到剩余样本的 85%，部分差异结果源于新鲜组织标本中低水平的小孢根霉 DNA。总体而言，泛毛霉目 PCR 能有效检测和确认组织学和培养阳性标本中的毛霉目 DNA，而靶向多重检测的敏感性相对较低，需进一步开展大规模研究，对比两种 PCR 检测与传统方法在不同标本类型中的检测敏感性。

讨论

及时准确检测临床标本中的毛霉目真菌，对启动靶向抗真菌治疗、改善患者预后至关重要。传统诊断方法，如培养和显微镜检查，存在诸多挑战。培养方法对处理和存储条件要求苛刻，组织病理学诊断依赖专业知识，无法进行物种鉴定，且常延迟诊断，影响患者治疗。虽然已有多种基于 PCR 的毛霉目检测方法，但商业检测存在成本高、无法进行物种鉴定等问题。

新开发的泛毛霉目 PCR 检测在多种临床标本检测中表现出色，敏感性达 98.6%，特异性为 100%。与现有商业 PCR 检测相比，如 MucorGenius、MycoGENIE 和 Fungiplex 等，泛毛霉目 PCR 检测具有更高的敏感性，这可能得益于其简化的设计，仅针对两个序列（18S rDNA 和 HBG），减少了竞争抑制，提高了检测敏感性；高特异性则归因于精心选择的引物和探针，以及优化的退火温度。

多重 PCR 检测作为泛毛霉目 PCR 的后续检测，可实现属 / 种水平的鉴定，对少根根霉、小孢根霉和毛霉属的敏感性分别为 93.8%、70.8% 和 75%。检测失败的原因多与标本中真菌 DNA 含量低有关，且无法检测到两栖毛霉，可能是由于基因组变异影响引物 / 探针结合位点。但该检测特异性良好，能快速鉴定澳大利亚最常见的三种毛霉目病原体，无需 PCR 后测序，为流行病学监测和疫情调查提供重要信息。对于泛毛霉目 PCR 阳性但多重 PCR 阴性的标本，可通过现有泛真菌 PCR 进行进一步鉴定。

与当前实验室采用的泛真菌 PCR 结合 DNA 测序的分子诊断方法相比，新提出的泛毛霉目 PCR 联合多重属 / 种特异性 PCR 检测算法显著缩短了检测时间。新鲜标本的泛毛霉目 PCR 结果可在样本接收后 24 - 48 小时内获得，检测本身仅需 3 小时，多重检测额外需要 4 - 5 小时，但这不会延误初始治疗，因为泛毛霉目 PCR 结果足以启动治疗。FFPE 标本检测时间较长，为 3 - 5 天，对于罕见毛霉目物种的鉴定时间与泛真菌 PCR 相当，但此类物种在澳大利亚相对少见。

新检测方法具有高度的通用性，可用于多种临床标本，对诊断侵袭性毛霉病具有重要价值。此外，将泛毛霉目 PCR 与实验室现有的曲霉（Aspergillus）PCR 相结合，有望提高对共感染的检测能力，因为曲霉病和毛霉病共感染并不罕见，且一线治疗曲霉病的伏立康唑对毛霉病无效。进一步在非侵入性样本类型（如血清）上验证该联合检测方法，可扩大其在高危免疫受损人群中的筛查和监测应用。从成本角度看，新检测算法更为经济，每个样本成本约为 35 澳元，多重检测额外 15 澳元，远低于泛真菌 PCR 结合测序的 100 澳元成本，更适合实验室常规使用。

本研究存在一定局限性。首先，以泛真菌 PCR 作为金标准可能高估了新开发检测方法的敏感性和特异性，还需开展更多分析和临床研究，对比新方法与传统诊断方法的性能。其次，由于 LightCycler 480 II 仪器的荧光通道限制，多重靶向 PCR 检测仅包含三个属 / 种特异性靶点，增加靶点可能降低敏感性，更可行的方法是开发包含更多毛霉目靶点的第二个靶向 PCR 检测。最后，多重靶向 PCR 无法检测两栖毛霉，但可通过泛毛霉目 PCR 检测到，若靶向检测阴性，可通过泛真菌 PCR 结合 ITS 测序进行物种鉴定。尽管存在这些局限性，多重靶向 PCR 仍为诊断、流行病学监测和疫情调查提供了有价值的信息，泛毛霉目 PCR 也能为启动毛霉病治疗提供关键信息。

综上所述，本文提出的两种连续实时 PCR 检测的简化诊断流程，在毛霉病诊断方面具有显著潜力，可实现快速、准确且经济高效的检测，有助于及时启动合适的抗真菌治疗，优化患者预后，同时为流行病学监测和疫情调查提供有力支持。