BSL-2 嵌合系统：新冠病毒 E 蛋白离子通道抑制剂筛选的新利器

本文构建了基于辛德毕斯病毒（SINV）背景的生物安全二级（BSL-2）嵌合病毒系统，用于研究新冠病毒（SARS-CoV-2）包膜（E）蛋白离子通道活性及筛选抑制剂，为开发抗新冠病毒药物提供新途径，有望推动抗病毒疗法的发展。

　　

引言

2019 年 12 月，新型严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）出现，引发全球大流行。截至 2024 年 9 月，新冠病毒病（COVID-19）已导致全球超 7 亿人感染、超 700 万人死亡。尽管已有疫苗及部分治疗方案，但高传播性的奥密克戎变异株及其亚变异株出现免疫逃逸，仍需寻找更有效的抗病毒药物和靶点。

病毒孔蛋白（viroporins）是一类能在宿主细胞膜上形成孔道的病毒蛋白，可干扰细胞正常功能、协助病毒感染，如甲型流感病毒 M2（IAV-M2）和甲病毒 6K 等。SARS-CoV-2 的 E 蛋白是最小的结构蛋白，属于病毒孔蛋白，其离子通道活性与病毒感染密切相关，在 β - 冠状病毒中高度保守，是潜在的抗病毒靶点。研究表明，阻断 E 通道可降低 SARS-CoV-2 感染水平。

由于对 SARS-CoV-2 的研究局限于生物安全三级（BSL-3）实验室，限制了潜在抗病毒化合物的筛选。本研究构建了以 SINV 为背景的 BSL-2 嵌合系统，用于研究 E 蛋白离子通道活性及筛选抑制剂。

材料和方法

1. 病毒和细胞：使用 BHK-21（幼地鼠肾细胞）和 Vero 细胞，分别在特定培养基中培养。
2. 质粒和克隆：合成 SARS-CoV-2 E 蛋白密码子优化序列，从 pToto64 中分离 6K 蛋白序列，将 6K 和 E 序列克隆到载体中。构建 Δ6K SINV 及 SINV-ETM 等突变体，所有序列经测序确认。
3. 体外转录和转染：用 SacI 线性化质粒，体外转录产生病毒 RNA，通过电穿孔转染 BHK-21 细胞，获得单克隆病毒并制备病毒库。
4. 噬斑实验：对病毒库进行系列稀释，接种 BHK-21 细胞，覆盖琼脂糖，培养后用中性红染色，计算噬斑数量确定病毒滴度。
5. 生长曲线分析：以不同感染复数（MOI）感染 BHK-21 细胞，分别进行一步生长曲线和连续生长曲线分析，通过噬斑实验测定病毒滴度。
6. qRT-PCR 和特异性感染性：对转染后细胞的上清液进行 qRT-PCR，测定病毒 RNA 拷贝数，结合噬斑实验结果计算特异性感染性（SI）。
7. 蛋白表达和纯化：在细菌中表达并纯化 SINV 6K、SARS-CoV-2 E 等蛋白，经多步处理后进行尺寸排阻色谱（SEC）进一步纯化。
8. 蛋白质免疫印迹分析（Western blot analysis）：将 SDS-PAGE 凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用特异性抗体检测 SARS-CoV-2 E 蛋白。
9. 抑制剂结合分析：将离子通道抑制剂与纯化蛋白孵育，透析去除未结合化合物，用分光光度计检测结合情况。
10. 细胞毒性测定（Cytotoxicity assay）：用不同浓度抑制剂处理细胞，以 WST-1 为底物进行细胞增殖检测，计算半数细胞毒性浓度（CC₅₀）。
11. 功效测定（Efficacy assay）：用不同浓度抑制剂处理感染病毒的细胞，通过检测 mCherry 荧光信号或噬斑实验测定病毒生长抑制情况，计算半数抑制浓度（IC₅₀）。
12. 出芽抑制测定（Egress inhibition assay）：感染细胞后不同时间加入抑制剂，收集上清液进行噬斑实验，检测对病毒出芽的影响。
13. 抑制剂添加时间测定（Time of inhibitor addition assay）：在病毒感染前后不同时间点添加抑制剂，检测对病毒感染的影响，分析离子通道在病毒生命周期中的作用阶段。
14. 噬斑数量减少测定（Plaque number reduction assay）：将病毒与抑制剂预孵育，过滤后进行噬斑实验，检测对病毒感染性的影响。

结果

1. SARS-CoV-2 E 蛋白跨膜结构域可部分替代 SINV 中 6K 离子通道结构域的功能：构建的 SINV-ETM 嵌合体中，用 SARS-CoV-2 E 蛋白跨膜结构域（ETM）替换 6K 的第一个跨膜螺旋。与 Δ6K SINV 相比，SINV-ETM 的噬斑大小和病毒滴度显著增加，生长动力学和特异性感染性也得到改善。引入 ETM 通道失活突变（N15A、V25F 及双突变 N15A, V25F）后，病毒表型恢复到类似 Δ6K SINV 的状态，表明 ETM 嵌合体可互补 6K 离子通道结构域的功能，且通道活性受突变影响。
2. 金刚烷胺和阿米洛利等通道抑制剂可减少 SINV 6K 和 SINV-ETM 嵌合体的病毒感染：通过紫外 - 可见吸收光谱检测发现，阿米洛利衍生物（HMA、EIPA、DMA）可与 SINV 6K、SARS-CoV-2 E 蛋白结合，突变体蛋白也能结合但程度稍弱。用 mCherry 标记病毒进行实验，结果显示，四种化合物（HMA、EIPA、DMA、金刚烷胺）对 SINV 和 SINV-ETM 嵌合体均有浓度依赖性抑制作用，对 Δ6K SINV 作用不明显。HMA 和 EIPA 的抑制效果优于 DMA，金刚烷胺的 IC₅₀浓度最高，与之前对真实 SARS-CoV-2 病毒的研究结果相似，验证了 6K 和 SARS-CoV-2 E 离子通道在 SINV 中的功能相似性。
3. 抑制剂添加时间测定揭示离子通道在 SINV 生命周期早期的功能作用：通过出芽抑制测定发现，通道抑制剂可降低 WT SINV 和 SINV-ETM 的病毒滴度，对 Δ6K SINV 影响较小，表明抑制剂对病毒出芽有抑制作用。抑制剂添加时间测定结果显示，在病毒感染早期添加抑制剂，可显著降低病毒感染水平，提示离子通道可能在 SINV 的进入和 / 或复制过程中发挥作用，但还需进一步研究验证。

讨论

SARS-CoV-2 的 E 蛋白在病毒生命周期中具有多种功能，包括参与病毒装配、释放、触发免疫反应和诱导细胞死亡等，靶向 E 蛋白通道活性的抗病毒药物有望对抗 COVID-19 感染。

本研究构建的荧光标记 SINV 嵌合系统可在 BSL-2 环境中筛选针对 SARS-CoV-2 E 蛋白离子通道活性的抑制剂，能快速测试已知抑制剂，也有潜力高通量测试新型抑制剂。研究发现，ETM 序列中的 N15A 突变体对抑制剂的抗性更强，可能与化合物结合位点改变有关。

虽然 viroporins 通常在感染后期发挥作用，但本研究表明离子通道可能在 SINV 进入过程中起作用，不过 E 离子通道在 SARS-CoV-2 进入过程中的作用尚未明确，还需进一步研究。此外，SINV 和 SARS-CoV-2 的病毒释放途径不同，SINV 嵌合系统在评估 E 通道功能方面存在一定局限性，但仍为研究通道抑制和筛选化合物库提供了有效工具。