探秘 HPV 感染与宫颈上皮内瘤变：微生物组与代谢组的关键线索

宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，HPV 感染是关键病因。本文通过多组学研究（16S rRNA 基因测序、代谢组分析等），探究宫颈阴道分泌物和组织微生物组及代谢物与 HPV 感染、宫颈上皮内瘤变（CIN）的关系，发现关键物种和代谢通路，为早期检测和治疗提供方向。

　　

研究背景

宫颈癌是女性生殖系统中最为常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐渐上升趋势。在中国，2022 年年龄标准化发病率为 13.83/10 万，死亡率达 4.54/10 万。人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈癌发生发展的关键因素，但影响 HPV 持续感染以及 CIN 和宫颈癌发病机制的因素尚未完全明确。

越来越多的证据表明，宫颈阴道微生物群在生殖道 HPV 感染的持续、CIN 甚至宫颈癌的发生中发挥着重要作用。研究发现，HPV 阳性女性更易出现以惰性乳杆菌（Lacticaseibacillus iners）为主导的（社区状态类型 [CST] III）或低乳杆菌的细菌性阴道病（BV）状态，且与宫颈病变的严重程度及特定 HPV 类型呈正相关。同时，微生物群可通过黏膜部位定植组织，影响组织微环境中的炎症和代谢等生物学过程，但目前关于组织内微生物组在 HPV 感染和 CIN 发展中的作用研究较少，宫颈阴道和组织内微生物组之间的关系也尚不明确。

阴道代谢反映了阴道微环境和宿主反应的特征，可能影响全身健康。HPV 感染会显著改变阴道代谢组，包括视黄醇代谢、生物胺、氨基酸、肽、谷胱甘肽代谢、脂肪酸和脂质代谢物等。而且，HPV 感染期间（宫颈）阴道微生物组和代谢组的变化之间存在密切联系。短链脂肪酸（SCFAs）已被证明可抑制多种病毒的进入和复制，但 SCFAs 对宫颈阴道 HPV 状态的影响尚未得到充分研究，将 SCFA 数据与非靶向代谢组数据相结合，可能为 HPV 感染和 CIN 发展提供更深入的见解。

材料与方法

1. 样本采集与研究设计：研究共招募了 122 名年龄在 20 - 50 岁的女性，最终 94 名符合标准的参与者被分为三组：CIN 组（n = 43，其中 CIN I 期 9 人，CIN II/III 期 34 人）、HPV 阳性对照组（NH 组，n = 24）和健康 HPV 阴性对照组（NC 组，n = 27）。排除了孕妇、哺乳期妇女、经期女性、近期使用过皮质类固醇或抗生素者、已知患有恶性肿瘤或免疫抑制疾病者以及正在接受免疫抑制治疗者。采集 4 份宫颈阴道分泌物样本，分别用于 pH 测量、HPV 基因分型、宫颈阴道微生物组分析、SCFAs 分析和非靶向代谢组学分析；宫颈组织在阴道镜检查时获取。使用 Hybribio HPV 基因分型试剂盒检测 HPV DNA，所有样本均储存于 -80°C 直至处理。
2. 五区域（5R）16S rRNA 基因测序：采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法结合 DP302 - 02 试剂盒提取冷冻样本的 DNA，由 LC - Bio Technology Co., Ltd. 进行 5R 16S rRNA 测序。利用 5R 扩增技术，在 Illumina NovaSeq 6000 平台上对文库进行测序。通过一系列过滤步骤去除污染，使用 QIIME 1 和 vegan 软件包评估细菌多样性，进行 alpha 多样性（Chao1、观察物种数、Shannon 和 Simpson 指数）和 beta 多样性（基于 Bray - Curtis 距离的置换多元方差分析 [PERMANOVA]）分析，采用 Mann - Whitney U 检验比较组间微生物群落差异，使用 pROC 软件包进行受试者工作特征（ROC）分析。
3. SCFAs 定量分析：用 80% 甲醇 - 水溶液沉淀代谢物，加入 1 - 乙基 - 3 -（3 - 二甲基氨基丙基）碳二亚胺溶液和 3 - 硝基苯肼进行衍生化，通过液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析。使用 AB Sciex Jasper 超高效液相色谱仪和 AB SCIEX 4500MD 三重四极杆质谱仪分离和定量目标化合物，采用 Mann - Whitney U 检验确定两组样本间的差异代谢物，使用 R 语言的 “stats” 软件包进行主成分分析（PCA）。
4. 非靶向代谢组学分析：按照先前研究方法进行代谢物提取、LC - MS 分析和代谢组学数据预处理。使用 MetaX 进行 PCA 和偏最小二乘判别分析（PLS - DA），通过 R 语言的 vegan 软件包基于 Bray - Curtis 距离进行 PERMANOVA 计算 P 值。采用双侧未配对 t 检验选择差异代谢物，筛选标准为：变量重要性投影（VIP）>1、P <0.05 且倍数变化> 1.2。
5. 统计分析：分类数据以计数或均值 ± 标准差（SD）表示。使用 χ2 检验分析分类变量，双侧未配对 t 检验分析连续变量，根据数据特征选择双侧未配对 t 检验或非参数 Mann - Whitney U 检验进行组间比较。使用 OmicStudio 工具计算 Pearson 相关系数生成微生物群、代谢物和临床指标之间的相关热图，使用 pROC 软件包进行 ROC 分析，使用 OmicStudio 工具进行网络分析，所有统计分析均使用 GraphPad Prism 7.0 和 SPSS 软件（标准 v.19.0），P 值表示为：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

研究结果

1. 参与者人群特征：最终纳入研究的 94 名参与者中，CIN 组与 NC 组相比，在年龄、体重指数（BMI）、宫颈阴道 pH、HPV 亚型和避孕方法等方面存在显著差异；NH 组与 NC 组相比，宫颈阴道 pH 和 HPV 亚型有显著差异；CIN 组和 NH 组之间无显著差异。共收集了 362 份样本用于多组学分析，包括 94 份宫颈阴道分泌物样本的细菌 5R 16S rRNA 基因代谢条形码分析、80 份宫颈组织样本的细菌 5R 16S rRNA 基因代谢条形码分析、94 份宫颈阴道分泌物样本的 SCFAs 靶向代谢组学分析和 94 份宫颈阴道分泌物样本的非靶向代谢组学分析。
2. 宫颈阴道分泌物和宫颈组织样本 5R 16S rRNA 测序结果概述：在门水平上，宫颈阴道分泌物中鉴定出 8 个门，宫颈组织样本中鉴定出 15 个门，其中 8 个门是共有的。在种水平上，宫颈阴道分泌物中鉴定出 620 种，宫颈组织中鉴定出 1029 种，仅有 129 种（8.5%）是共享的。分析 20 种最丰富的细菌物种发现，11 种在两种样本类型中都存在，优势物种包括 Lacticaseibacillus iners、Lacticaseibacillus crispatus、Lacticaseibacillus jensenii 以及一些厌氧菌，如 Gardnerella vaginalis、Atopobium vaginae 等，表明虽然宫颈阴道分泌物和宫颈组织的微生物组成存在差异，但某些关键物种在两个环境中都发挥着重要生态作用。
3. 宫颈阴道分泌物中的细菌多样性和组成：在门水平上，NC、NH 和 CIN 组鉴定出的大多数门是相同的；在种水平上，三组分别鉴定出 336、246 和 305 种细菌。Alpha 多样性分析显示，CIN 组和 NC 组在观察特征和 Chao1 指数上存在显著差异，而 Shannon 和 Simpson 指数无显著变化。主坐标分析（PCoA）表明，NH 与 NC、CIN 与 NC、CIN 与 NH 组之间均无显著差异。通过无监督聚类将细菌分为三个簇，簇 I 和 III 分别以 L. crispatus 和 L. iners 为主，簇 II 中 Lacticaseibacillus 物种减少，厌氧或兼性厌氧细菌多样性增加。L. iners 在簇 III 中占主导，与 CIN 的发生相关，感染 HPV 后其丰度先增加后降低。Mann - Whitney U 检验确定了 NH 组与 NC 组相比有 7 种差异丰富细菌物种（DABs），CIN 组与 NC 组相比有 20 种，CIN 组与 NH 组相比有 4 种，这些 DABs 与 HPV 获取、持续感染和 CIN 进展有关。
4. 宫颈组织中的细菌多样性和组成：在门水平上，NC、NH 和 CIN 组存在显著重叠；在种水平上，三组分别鉴定出 456、365 和 625 种不同细菌。Alpha 多样性分析显示，NH 组与 NC 组、CIN 组与 NC 组在观察特征指数上存在显著差异，Chao1、Shannon 和 Simpson 指数无显著差异。PCoA 显示，NH 与 NC、CIN 与 NC 组之间存在显著差异，CIN 与 NH 组之间无显著差异。无监督聚类揭示出两个不同的簇，簇 I 主要由 Lacticaseibacillus 物种组成，簇 II 以 G. vaginalis 和各种厌氧或兼性厌氧细菌为主，CIN 组中簇 II 细菌的比例增加。Mann - Whitney U 检验确定了 NH 组与 NC 组相比有 10 种 DABs，CIN 组与 NC 组相比有 19 种，CIN 组与 NH 组相比有 12 种，这些 DABs 可能在 HPV 获取、持续感染和 CIN 发展中起作用。
5. NC、NH 和 CIN 组的宫颈阴道代谢组学特征：SCFAs 靶向分析显示，NH 组和 NC 组之间存在明显聚类，但两组间 SCFAs 水平无显著变化。非靶向代谢组学分析鉴定出 1387 种代谢物，PCA 和 PLS - DA 显示 NC、NH 和 CIN 组之间无明显聚类。进一步分析发现，NH 与 NC、CIN 与 NC、CIN 与 NH 组比较中，分别有 50、220 和 111 种代谢物发生显著变化，且只有 2 种（0.72%）代谢物在三组比较中均出现。代谢物富集分析表明，甘油磷脂代谢是 CIN 患者中最显著失调的 KEGG 通路，提示其可能在 HPV 获取、持续感染和 CIN 发展中发挥作用。
6. 宫颈阴道分泌物中细菌和代谢物与临床指标的关键相关性：Pearson 相关分析表明，改变的代谢物与 HPV 状态之间存在显著相关性，尤其是在 NH 和 NC 组以及 CIN 和 NC 组中。整合细菌物种和代谢物的预测模型在区分 NH 与 NC 组（曲线下面积 [AUC] = 0.98）、CIN 与 NC 组（AUC = 1.0）和 CIN 与 NH 组（AUC = 0.90）方面具有高灵敏度。此外，还发现 L. iners 与 HPV 状态在 NH 和 NC 组中呈正相关，以及代谢物、HPV 状态和 BMI 之间的相关性，表明宫颈阴道细菌、甘油磷脂代谢、HPV 状态和 BMI 之间存在密切相互作用。
7. 宫颈组织中细菌和代谢物与临床指标的关键相关性：Pearson 相关分析显示，宫颈组织中改变的细菌和代谢物与 HPV 状态（NH 与 NC、CIN 与 NC 组）以及改变的细菌与 pH 变化（NH 与 NC 组）之间存在显著相关性。预测模型在区分所有三组比较中具有出色的灵敏度（AUC = 1.0）。进一步分析发现，L. iners 与 HPV、P. bivia 与 pH 在 NH 和 NC 组中呈正相关，以及其他一些细菌与 HPV、代谢物与 HPV 状态和 BMI 之间的相关性。特别值得注意的是，发现了两种特定的细菌 - 代谢物 - HPV 联系：P. bivia–PE (18:1/0:0)–HPV 和 F. periodonticum–PI 40:6–HPV，表明宫颈组织细菌、甘油磷脂代谢、HPV 状态和 BMI 之间存在重要相互作用。

讨论

通过对宫颈阴道分泌物和宫颈组织样本的 5R 16S rRNA 测序分析，发现这两个环境中的微生物多样性存在显著差异。在门水平上，宫颈阴道样本中的所有门都存在于宫颈组织中，但在种水平上，两者仅有 8.5% 的重叠，且 20 种最常见细菌物种中有一半以上是共有的。优势物种包括多种 Lacticaseibacillus 菌株和潜在致病性厌氧菌，这与先前研究一致，表明某些关键物种在宫颈阴道分泌物和宫颈组织的微生物组中都至关重要。

在 CIN 和 NC 组的宫颈阴道分泌物和宫颈组织中，观察到 alpha 多样性指数（观察物种数）降低，但 Shannon 和 Simpson 指数无显著变化，这表明 CIN 可能导致某些细菌物种的丢失或显著减少。同时，在宫颈组织中发现 beta 多样性改变，而宫颈阴道分泌物中未发现，说明 CIN 主要影响组织微环境。相关分析表明，特定细菌如 L. iners 可能参与介导 HPV 感染，其他细菌如 P. bivia 等可能与 HPV 持续感染和 CIN 进展有关。

L. iners 在健康和失调状态下分别具有有益和致病特征，与 HPV 感染呈强正相关。在宫颈阴道分泌物中，其丰度在 HPV 感染过程中先增后减，在 CIN 病例中尤为普遍，表明其对 HPV 感染和清除有影响。P. bivia 是与细菌性阴道病相关的厌氧菌，能产生脂多糖并粘附、侵入宫颈上皮细胞，与 HPV 持续感染有关。其他厌氧或兼性厌氧细菌在正常情况下是共生菌，但可能作为机会致病菌，其丰度变化可能破坏体内平衡，促进有害病原体生长，这些细菌的存在和动态变化可能有助于 HPV 获取、持续感染和 CIN 进展。

目前对与 HPV 感染及其进展为 CIN 相关的代谢特征了解有限。SCFAs 主要发挥抗炎作用，但本研究中 NH 和 CIN 组的 SCFAs 水平无显著降低，表明其可能在 HPV 感染和 CIN 发展中不起关键作用。脂质在炎症过程中起重要作用，本研究发现甘油磷脂代谢是 CIN 患者中最显著失调的通路，且特定细菌 - 代谢物相互作用（如 P. bivia–PE (18:1/0:0)–HPV 和 F. periodonticum–PI 40:6–HPV）表明宫颈组织细菌与脂质代谢之间存在重要关系，可能促进炎症反应，有利于 HPV 持续感染和 CIN 进展。

本研究的优势在于采用多组学分析，全面比较了宫颈阴道分泌物和宫颈组织的微生物组成，并利用靶向和非靶向代谢组学研究了代谢物变化与微生物群变化之间的关系。然而，研究也存在局限性。样本量相对较小，需要在更大、更多样化的队列中进行验证，且无法区分 CIN 等级差异；研究为横断面研究，无法确定微生物和代谢变化与疾病进展之间的因果关系，需要进一步的纵向研究；虽然确定了特定微生物物种与 HPV/CIN 之间的关联，但未探究潜在机制；SCFAs 水平在组间未显示显著差异，可能与样本量或检测方法的局限性有关。未来研究应扩大样本量，进行多部位 SCFAs 检测，采用更灵敏的检测方法，并从分子水平研究微生物及其代谢物对 HPV 持续感染和 CIN 发展的影响机制。

综上所述，本研究鉴定了宫颈阴道分泌物和宫颈组织中的多种细菌物种，揭示了其组成的显著差异，以及 NC、NH 和 CIN 组之间细菌多样性和组成的变化，特定细菌物种与 HPV 感染和 CIN 进展相关。代谢组学分析发现甘油磷脂代谢改变，但未观察到与 HPV 相关的 SCFAs 显著变化。微生物组和代谢组数据的整合可有效区分患者组，为 HPV 获取和 CIN 进展提供了潜在的生物标志物。