揭示空肠弯曲菌耐热奥秘：ClpB 蛋白独特解聚机制的关键作用

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是重要食源性病原体。本文通过研究 86 株菌，发现其耐热性与系统发育相关，ClpB 蛋白在耐热中起关键作用，且不依赖 DnaK 解聚蛋白聚集体。研究为防控该菌污染、保障食品安全提供关键依据。

　　

引言

空肠弯曲菌是全球食源性疾病的主要致病菌，主要经污染的禽肉传播给人类。其感染人体后症状多样，还可能引发严重并发症。该菌最适生长温度为 42°C ，但对环境压力敏感，生长要求苛刻，缺乏部分其他食源性病原体保守的应激适应反应。

目前，关于热休克蛋白在空肠弯曲菌耐热性中的作用信息有限。虽然此前研究表明，空肠弯曲菌在热应激时会增加热休克蛋白（如 ClpB、DnaK 和 GroESL）的表达水平，也有研究关注热应激下伴侣蛋白的表达及调节因子的结合变化，但热休克蛋白在空肠弯曲菌中的具体作用仍不清楚。

在禽肉加工过程中，鸡可能会经历 50 - 60°C 的烫洗处理以脱毛，这一过程会影响空肠弯曲菌的存活，然而该菌常能在处理后存活，引发食品安全问题。此外，不同空肠弯曲菌菌株（尤其是克隆复合体，CC）的耐热性差异对其在食品加工和环境压力下的存活有重要影响，但目前尚未明确特定 CC 与耐热性之间的关联。因此，本研究旨在揭示空肠弯曲菌不同菌株耐热性差异的机制，为食品安全和公共卫生提供帮助。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养条件：选用 86 株从零售生鸡肉中分离的空肠弯曲菌菌株监测耐热性，以空肠弯曲菌 NCTC 11168 为野生型。空肠弯曲菌在 Mueller - Hinton 培养基、42°C、微需氧条件（5% O₂、10% CO₂、85% N₂）下培养，大肠杆菌（E. coli）在 Luria - Bertani 培养基、37°C、需氧条件下培养，必要时添加抗生素。
2. 空肠弯曲菌突变体和互补菌株的构建：构建空肠弯曲菌 NCTC11168 的clpB、dnaK、groESL、hrcA和hspR缺失突变体及相应互补菌株，通过 PCR、测序进行筛选和验证。
3. 耐热性测试：将过夜培养的菌液调整浓度后，在 50°C 孵育 60 min，定时取样进行系列稀释和细菌计数。
4. 测定 D - 值：通过线性回归技术测定 D - 值，即热处理时杀死 90% 微生物所需的时间，根据 50°C 下的热灭活曲线计算。
5. 模拟鸡烫洗条件下的耐热性测试：制备空肠弯曲菌接种的鸡皮样本，模拟鸡烫洗处理，在 50°C 处理 5 min，定时取样检测细菌数量。
6. 细菌腺苷酸环化酶双杂交系统测定：利用该系统检测 ClpB 和 DnaK 的蛋白相互作用，通过平板检测和液体检测 β - 半乳糖苷酶活性。
7. 蛋白质聚集体定量：用 PROTEOSTAT 染料染色，在特定波长下测量荧光，以相对荧光单位（RFU）/CFU 表示。
8. 共聚焦荧光显微镜观察：对处理后的样本进行染色、固定，在共聚焦激光扫描显微镜下观察。
9. 横断面透射电子显微镜观察：对样本进行固定、染色、脱水、包埋、切片，在透射电子显微镜下观察。
10. 序列比对和系统发育分析：基于 ClpB 同源物的氨基酸序列比对构建系统发育树。
11. 统计分析：采用 Student’s t - 检验和 χ 检验进行数据分析。

结果

1. 空肠弯曲菌表现出多样的耐热性特征且与系统发育相关：测试 86 株空肠弯曲菌在 50°C 的存活情况，根据 60 min 热处理后的对数减少值将菌株分为耐热和热敏两组。热敏菌株的对数减少值显著高于耐热菌株。在热敏菌株中，MLST CC - 21 菌株占比高；耐热菌株中，CC - 443 和 CC - 607 菌株占比显著较高，表明空肠弯曲菌的耐热性与系统发育有关。
2. ClpB 在空肠弯曲菌烫洗条件下的存活中起关键作用：测试热休克伴侣基因敲除突变体在 50°C 的存活情况，ΔclpB敲除突变体在 50°C 下存活率迅速下降，D - 值显著低于野生型，clpB互补菌株恢复了 D - 值。ΔhspR突变体在热应激下存活率增强，可能与 ClpB 的去抑制有关。在模拟鸡烫洗条件下，ΔclpB突变体存活率显著低于野生型，互补菌株恢复到野生型水平，表明 ClpB 对空肠弯曲菌在热应激下的存活至关重要。
3. 空肠弯曲菌 ClpB 不与 DnaK 结合：通过细菌腺苷酸环化酶双杂交系统测定，发现空肠弯曲菌的 DnaK 和 ClpB 不相互结合，而大肠杆菌的 DnaK 和 ClpB 有明显相互作用。这表明 ClpB 在空肠弯曲菌热应激下的耐热作用不依赖与 DnaK 的直接结合。
4. ClpB 帮助空肠弯曲菌减轻热应激导致的蛋白质聚集体形成：用 PROTEOSTAT 染料检测蛋白质聚集体，发现热应激后所有样本的蛋白质聚集体增加，ΔclpB突变体在 10 min 和 20 min 后的蛋白质聚集体水平显著高于野生型。共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察也证实了 ΔclpB突变体中蛋白质聚集体更多，表明 ClpB 通过减轻热应激时蛋白质聚集体的形成，在空肠弯曲菌耐热性中起关键作用。
5. CC - 443 组中 ClpB 的独特多态性：对 86 株空肠弯曲菌的 ClpB 氨基酸序列进行系统发育分析，发现 CC - 443 组的 ClpB 与其他组相比，在 N 末端结构域（NTD）和第二个核苷酸结合结构域（NBD - 2）有独特的氨基酸替换，这些替换可能与空肠弯曲菌菌株的耐热性差异有关。

讨论

本研究发现空肠弯曲菌在热应激下的存活能力存在菌株依赖性差异，CC - 443 菌株在耐热菌株中占比高，且与人类和家禽来源相关，可能因其增强的应激耐受性而具有较高的食源性传播潜力，但还需进一步研究其对人类感染的潜在威胁。

在热休克蛋白功能方面，ClpB 在空肠弯曲菌耐热性中起关键作用，ΔclpB突变体在热应激下存活率显著降低，D - 值明显变化。虽然 ΔhspR突变体存活率升高可能与 ClpB 表达增加有关，但 HspR 与 ClpB 的调控关系还需进一步研究。

与大肠杆菌不同，空肠弯曲菌的 ClpB 和 DnaK 不相互结合，ClpB 在无 DnaK 合作的情况下发挥耐热作用，但 ClpB 是独立作为解聚酶还是与其他伴侣蛋白合作仍需研究。此外，CC - 443 组 ClpB 在 NTD 和 NBD - 2 的氨基酸替换可能影响其解聚活性，进而增强该克隆复合体的耐热性，但具体作用还需实验验证。

总之，本研究揭示了 ClpB 在空肠弯曲菌耐热性中的重要作用，以及不同菌株耐热性差异与系统发育的关系。这对于理解空肠弯曲菌在食品加工中的存活机制，制定有效的防控策略，保障食品安全具有重要意义。