多重环介导等温扩增（LAMP）联合试纸条色谱法：精准鉴别牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的新利器

本文介绍了一种多重环介导等温扩增（LAMP）联合试纸条色谱法，可快速鉴别牛分枝杆菌（M. bovis）和结核分枝杆菌（M. tuberculosis）。该方法灵敏度高、特异性强，成本低，适用于资源有限地区，对结核病防控意义重大。

　　

引言

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）分别是人和动物结核病（tuberculosis，TB）的病原体。牛结核病是重要的人畜共患病，据世界卫生组织（WHO）估计，全球每年有大量人畜共患结核病新发病例和死亡病例。在非洲部分国家，约 2.8% 的人类新发结核病病例由牛分枝杆菌引起。

结核病的常规治疗方案包含异烟肼（INH）、利福平（RIF）、乙胺丁醇（EMB）和吡嗪酰胺（PZA），吡嗪酰胺是治疗耐多药结核病（MDR-TB）的关键药物，可在结核分枝杆菌存活的酸性环境中发挥作用。但牛分枝杆菌对吡嗪酰胺天然耐药，若将牛分枝杆菌引起的结核病误诊为结核分枝杆菌所致，使用含吡嗪酰胺的治疗方案，不仅会导致治疗失败，还会使患者暴露于有毒药物中。因此，准确区分这两种菌对合理治疗和疾病防控至关重要。

传统的细菌培养和生化检测方法在区分牛分枝杆菌和结核分枝杆菌时，存在费力、耗时且不可靠的问题，因为部分菌株的生化模式多变或呈中间型。核酸扩增试验（NAATs）虽可靠，但设备和维护成本高，不利于在资源有限的地区常规使用。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种快速、低成本的等温 DNA 扩增技术，利用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶进行扩增。已有多种基于 LAMP 的方法用于检测结核分枝杆菌，但这些方法多局限于检测单一靶点。而多重 LAMP 技术可在同一反应中同时检测多个 DNA 靶点，结合不同的可视化方法，如基于荧光猝灭的探针、DNA 侧向流动试纸条技术等，能区分多个扩增产物。其中，DNA 侧向流动试纸条技术因成本效益高而备受关注。

单链标签杂交色谱打印阵列条（Single-stranded tag hybridization chromatographic printed-array strip，STH C-PAS）是一种基于 DNA-DNA 杂交和 DNA 侧向流动试纸条原理的技术，可同时区分多个扩增产物。在该技术中，目标 DNA 用生物素标记的引物和独特的单链标记引物进行扩增，扩增产物与链霉亲和素包被的蓝色乳胶珠结合，通过毛细管作用在试纸条上移动，与试纸条上的互补序列杂交，形成可见的蓝色条带，指示样本中目标 DNA 的存在。本文旨在开发一种低成本的多重 LAMP-PAS 检测方法，用于快速、同时鉴别牛分枝杆菌和结核分枝杆菌，并监测人畜结核病情况。

材料与方法

1. 研究样本：研究共使用了 143 株分枝杆菌和非分枝杆菌菌株，包括 6 株结核分枝杆菌复合群（MTB）参考菌株、24 株非结核分枝杆菌（NTM）参考菌株、5 株非分枝杆菌呼吸道参考菌株、58 株结核分枝杆菌临床分离株和 50 株牛分枝杆菌组织分离株。部分菌株由日本相关实验室提供，部分临床样本从马拉维和赞比亚的动物和患者中收集。所有临床或组织分离株均通过 spoligotyping 和多重 PCR 确认为结核分枝杆菌或牛分枝杆菌。
2. 样本储存和 DNA 提取：参考菌株保存在 20% 甘油中，于 - 80℃储存。临床和组织分离株在合作实验室保存，仅将提取的 DNA 样本转移至日本。参考菌株和大阪分离株的基因组 DNA 采用珠磨法提取，经氯仿纯化和乙醇沉淀；液体培养基中培养的临床和组织分离株，通过反复煮沸和冷冻提取粗 DNA；固体培养基上的分离株，将菌落悬浮于 TE 缓冲液后，同样经反复煮沸和冷冻提取 DNA，最后离心取上清作为样本，提取的 DNA 样本保存于 - 30℃。
3. 多重 LAMP 引物：根据先前报道的 LAMP 方案，合成了两组特异性引物。一组针对牛分枝杆菌 RD4 区域，另一组针对 MTB 的 16S rRNA 基因。牛分枝杆菌 RD4 引物对牛分枝杆菌 RD4 缺失具有特异性，16S rRNA 引物可靶向所有 MTB 生物变种。对部分引物的 5' 末端进行修饰，包括添加碳间隔子、独特标签序列和生物素标记，其他未修饰引物由日本生命技术有限公司合成。
4. 多重 LAMP 扩增：LAMP 反应混合物与先前报道相同，但对引物进行不同比例稀释以优化灵敏度和特异性。反应在 25 μL 体系中进行，包含 DNA 模板、特异性引物、甜菜碱、Tris-HCl、脱氧核苷三磷酸混合物、KCl、(NH₄)₂SO₄、Tween 20、MgSO₄和Bst DNA 聚合酶，加水补足体积。混合物在 66℃孵育 60 min，以浊度曲线增加超过 0.1 为阳性结果。以牛分枝杆菌 BCG Tokyo 172 和结核分枝杆菌 H37Rv 的提取 DNA 为阳性对照，双蒸水为阴性对照，反应在洁净室准备，在扩增室添加 DNA 模板。
5. 通过试纸条 DNA 色谱法（C-PAS）可视化多重扩增产物：多重 LAMP 反应后，将 C-PAS F4 膜条插入含有显色液、链霉亲和素包被的蓝色乳胶悬浮液和 LAMP 产物的混合液中，室温孵育 10 min 后判读结果。试纸条检测位置出现蓝色条带，表明存在与互补寡核苷酸和生物素标记的扩增目标 DNA 序列。在单独的后扩增室进行 LAMP 扩增产物的可视化检测。
6. 特异性分析：以 MTB 参考菌株、NTM 菌株、非分枝杆菌呼吸道菌株、结核分枝杆菌临床分离株和牛分枝杆菌组织分离株为样本，评估多重 LAMP 的特异性，并与靶向 RD4 的多重 PCR 检测结果进行比较。对多重 PCR 反应体系和程序进行了略微修改，扩增产物经凝胶电泳分析。
7. 检测限（LoD）评估：使用系列稀释的牛分枝杆菌 BCG Tokyo 172 和结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA，浓度范围为 250 pg/μL 至 25 fg/μL，用 Qubit 3 荧光计测量 DNA 浓度，多次进行反应评估检测限。

结果

1. 多重 LAMP 快速鉴别牛分枝杆菌和结核分枝杆菌：优化了多重 LAMP 反应条件，确定了各引物的最佳浓度，RD4 LAMP 引物组中 FIP/BIP 为 1.6 μM、LF/LB 为 0.8 μM、F3/B3 为 0.2 μM；MTB LAMP 引物组中 FIP/BIP 为 0.8 μM、LF/LB 为 0.4 μM、F3/B3 为 0.1 μM 。最佳孵育温度为 66℃，时间为 60 min。多重 LAMP 反应结果 60 min 内可得，试纸条色谱法可视化结果需 10 min。
2. 多重 LAMP 的特异性：用多种菌株评估多重 LAMP 检测的特异性，牛分枝杆菌分离株的反应混合物在 C-PAS 上显示两条阳性带，分别指示牛分枝杆菌特异性 RD4 和 MTB 16S rRNA 的存在；结核分枝杆菌分离株和其他非牛分枝杆菌 MTB 菌株的反应仅显示一条阳性带，指示检测到 MTB 16S rRNA。所有结果与多重 PCR 结果一致。非分枝杆菌菌株检测均为阴性，但在 24 株 NTM 中，M. marinum、M. ulcerans和M. asiaticum对 16S rRNA 基因检测呈阳性，这是因为它们的 16S rRNA 基因目标区域与 MTB 序列高度相似。
3. 多重 LAMP 的检测限：多重 LAMP 可在 60 min 内检测到低至 500 fg 的牛分枝杆菌和结核分枝杆菌基因组 DNA，当 DNA 浓度为 1 pg / 反应或更高时，可正确区分两种菌。浓度低于 500 fg / 反应时，有时检测结果为阴性或牛分枝杆菌 BCG 样本中会缺失一条带，因此将反应孵育时间设定为 60 min，1 pg / 反应作为差异检测限，扩增产物可在 10 min 内通过 C-PAS 轻松区分。

讨论

在部分非洲国家，10% - 30% 的人类结核病病例由牛分枝杆菌引起，但由于诊断限制，牛分枝杆菌的鉴别仍未常规开展，这可能导致治疗不当和不良治疗结果。本文开发的多重 LAMP 联合试纸条色谱法可快速鉴别牛分枝杆菌和其他 MTB，该方法能在同一反应中同时扩增多个靶序列，节省时间和精力。

目前，能特异性检测牛分枝杆菌的方法较少，这是因为牛分枝杆菌与其他 MTB 菌株在基因和基因组区域上差异很小。MTB 菌株的进化以基因组缺失为特征，难以找到仅特定生物变种保留的基因组区域。虽然已报道一些生物变种特异性点突变，但除 PCR 方法外，现有等温扩增技术难以重现性地识别这些点突变。基于此，目前最可靠的牛分枝杆菌鉴定区域是 RD4，该区域在所有已知牛分枝杆菌菌株中均缺失，长度为 12.7 kbp，可有效防止 LAMP 方法中的非特异性扩增。16S 核糖体 RNA 基因是细菌物种鉴定的参考基因，其可变区域可用于 MTB 鉴定，能区分 MTB 与其他细菌，且在 MTB 菌株内匹配度高。本研究中，M. marinum、M. ulcerans和M. asiaticum对 MTB 16S rRNA 基因检测呈阳性，但因其发病机制、流行病学特征与 MTB 不同，且M. asiaticum临床分离率低，不会对 MTB 物种鉴定造成混淆。尽管多重 LAMP 方法的检测限略高于单一 LAMP 方法，但 1 pg DNA 相当于 200 个 MTB 杆菌，足以满足检测需求并区分生物变种。

LAMP 是优秀的等温扩增方法，仅需Bst聚合酶即可实现。但仅依靠扩增结果判断阳性或阴性存在无法区分非特异性扩增的缺点。虽然有多种方法可同时识别多个扩增产物，如荧光猝灭系统，但最简单实用的方法是使用侧向流动试纸条，通过不同条带捕获扩增产物，避免非特异性扩增的干扰。STH C-PAS 技术以单链 DNA 为捕获探针，通过添加互补序列标签捕获目标，可在同一条试纸上实现多个捕获，便于未来扩展检测靶点。

本研究存在一定局限性，未使用患者痰液或牛结核病病变部位直接采集的标本进行检测，这是由于在日本等无牛结核病的国家难以获取此类标本。后续计划将该检测系统应用于结核病流行国家，使用医院和屠宰场的标本进行进一步测试。此外，在基础设施不完善、缺乏冷却系统的农村地区实施该项目时，需解决冷链问题。鉴于本研究中使用的两种 LAMP 系统均可单独制成干燥 LAMP 系统，计划将两者混合干燥，以确认其稳定性和可重复性。若成功制成干燥的多重 LAMP 系统，仅需水浴即可实施检测。

目前，由牛分枝杆菌引起的结核病真实负担尚不清楚。该多重 LAMP-PAS 检测方法可作为流行病学工具，调查牛分枝杆菌引起的结核病流行情况，也可用于 MTB 成员的常规检测，尤其是对吡嗪酰胺敏感的结核分枝杆菌。最重要的是，快速区分牛分枝杆菌和结核分枝杆菌有助于制定合适的治疗方案和公共卫生防控措施。

综上所述，本研究开发了一种简单快速的多重 LAMP-PAS 系统，可同时鉴别牛分枝杆菌和结核分枝杆菌。该检测方法准确性高、操作简便、成本低，适用于资源匮乏国家的现场检测，对人畜结核病的早期诊断、管理和控制具有重要意义。