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本文发现了四种天然的 CdnP（Rv2837c）抑制剂，包括一种香豆素衍生物和三种黄酮苷。它们能有效抑制 CdnP，通过独特机制发挥作用，且具有抗结核潜力，为开发新型抗结核宿主导向疗法奠定基础。
结核病现状与 CdnP 的作用
结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的严重传染病，在 2023 年，全球约 1080 万人感染结核病，125 万人因结核病死亡，其防控形势严峻，尤其是耐药结核病的出现，给全球控制工作带来巨大挑战。
结核分枝杆菌产生的多功能酶 CdnP（Rv2837c）具有寡核糖核酸酶和 3′(2′)- 磷酸腺苷 5′- 磷酸（pAp）磷酸酶活性。它能降解多种底物，包括细菌环二核苷酸（CDNs）如 c - di - AMP、c - di - GMP，以及宿主来源的 2′,3′- c - GAMP 。这些 CDNs 作为病原体相关分子模式，可激活先天免疫反应，特别是刺激干扰素基因（STING）依赖的 I 型干扰素（IFN - α 和 IFN - β）信号通路。同时，CDNs 在细菌众多细胞过程中发挥关键调节作用 。而 CdnP 通过降解这些 CDNs，阻碍宿主免疫反应，在结核分枝杆菌致病过程中扮演重要角色。
天然 CdnP 抑制剂的筛选与鉴定
为寻找新型抗结核药物，研究人员对内部化合物库和商业资源中的天然产物化合物库进行系统筛选。内部库是多年天然产物研究成果，商业库整合了多个供应商和数据库资源，重点关注天然产物库。
由于 CdnP 以二聚体形式发挥作用，研究人员针对二聚体 CdnP 模型 5JJU 中一条链（链 A）的活性位点进行虚拟筛选。此前研究发现某些已验证的抑制剂是底物 ApA 的结构类似物，基于此，筛选出众多有潜力的化合物，并挑选出对接分数最低的 100 种进行后续实验验证。
接着，利用基于荧光的高通量酶活性测定法进行二次筛选。c - di - AMP 可与 coralyne 相互作用，保护其免受卤离子的荧光猝灭并增强荧光，而水解产物（pApA 或 AMP）无此保护作用。通过监测荧光变化，能确定潜在的 CdnP 抑制剂。经过两轮筛选，确定了四种天然产物为有效的 CdnP 抑制剂，分别是一种香豆素衍生物（macrosporusone A）和三种黄酮苷（ligustroflavone、neodiosmin 和 rhoifolin）。
抑制剂对 CdnP 的抑制特性
采用已建立的高通量筛选测定法测定四种天然产物的 IC50值，验证其抑制特性。结果显示，四种化合物均能有效抑制 CdnP，其中 neodiosmin 表现出极强的抑制活性（IC50 = 5.50 μM）。相比之下，四种 FDA 批准的磷酸二酯酶（PDE）抑制剂（cilostazol、cilomilast、sildenafil 和 tadalafil）在高浓度（1 mM）下对 CdnP 无明显抑制活性。
利用表面等离子共振（SPR）技术进一步测定化合物与 CdnP 的结合亲和力。四种天然产物的结合亲和力在微摩尔至纳摩尔浓度范围，其中 macrosporusone A 亲和力极高（KD = 0.64 pM），远超过 FDA 批准的 PDE 抑制剂 cilomilast 和 cilostazol ，另外两种 PDE 抑制剂在相同实验条件下与 CdnP 无明显结合。
分子对接与动力学模拟分析
对四种天然化合物和两种 PDE 抑制剂进行标准精度分子对接分析，结果表明所有化合物都倾向于结合到 AMP 结合口袋，而非 pApA 结合位点。
在分子动力学（MD）模拟中，研究人员对四种天然 CdnP 抑制剂与 CdnP 的相互作用，以及酶的无配体（apo）和内源性配体结合状态进行研究。模拟结果显示，在 100 ns 的模拟期内，所有配体（内源性配体和抑制性化合物）都能在 CdnP 活性位点稳定结合。
通过均方根偏差（RMSD）计算发现，虽然 CdnP 在结合配体后有轻微波动，但配体始终处于各自结合口袋内。CdnP 每个单体配位两个 Mn2+离子，结合配体后，离子表现出不对称行为，靠近链 A（pApA 结合）的离子构象波动更大，但所有 Mn2+离子都未显著偏离初始坐标。
均方根波动（RMSF）分析显示，链 A（容纳底物 pApA）在 apo 状态和内源性配体结合状态下，比链 B（容纳产物 AMP）构象更灵活，尤其是在活性口袋周围的残基 125 - 150 和 300 - 310 区域。结合化合物后，两条链的波动都减小，特别是在靠近活性位点的区域。这表明抑制性化合物与 CdnP 的稳定相互作用，同时限制了 apo - CdnP 在底物容纳过程中的构象变化，可能影响催化效率或产物释放。
测量活性口袋内关键残基对之间的距离发现，链 A 的活性口袋在 apo 状态和内源性配体结合状态下构象波动大，结合化合物后收缩且结构稳定性增强；链 B 中所有配体都能减少构象波动。计算回转半径（Rg）及其在三个主轴上的分解值发现，化合物结合状态下 RgX 和 RgY 的波动小于 apo 状态和内源性配体结合状态，这与 RMSF 模式和配体对活性口袋流动性的限制一致 。
通过 gmx_MMPBSA 计算量化 CdnP 单体之间以及 CdnP 与配体之间的相互作用能，结果表明化合物结合对链间亲和力影响较小，但能维持或增强 CdnP - pApA 相互作用。所有化合物都有稳定的结合能，ligustroflavone 和 neodiosmin 的结合能与内源性配体 AMP 相当甚至更优。能量分解分析揭示了化合物之间不同的残基特异性相互作用模式。
抑制剂的广谱抗菌潜力
通过对结核分枝杆菌 CdnP 进行蛋白质 - 蛋白质 BLAST 分析，发现其同源物存在于 15 个细菌门中，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。构建系统发育树分析进化关系，并纳入已表征的环二核苷酸磷酸二酯酶进行比较。
分析发现，分枝杆菌属的同源物与结核分枝杆菌 CdnP 序列同一性高（均超 79%），其他谱系的同源物序列相似性较低（低于 40%）。对可用结构进行比对发现，分枝杆菌属同源物与结核分枝杆菌 CdnP 的均方根偏差（RMSD）值最低，其他同源物 RMSD 值低于 5，已表征的磷酸二酯酶 RMSD 值最高 。
评估四种天然产物和两种参考 PDE 抑制剂对已鉴定的 CdnP 同源物的抑制活性，结果显示，三种天然产物对细菌 CdnP 同源物具有广谱抑制作用，对分枝杆菌属的同源物抑制活性尤其高；macrosporusone A 对属外同源物抑制效果有限。ligustroflavone 对细菌 CdnP 同源物抑制活性出色，对宿主来源的 2′,3′ - cGAMP 特异性磷酸二酯酶抑制作用极小，具有良好的选择性和较低毒性。相比之下，参考抑制剂 cilomilast 和 cilostazol 对细菌磷酸二酯酶抑制作用差，对宿主来源的 2′,3′ - cGAMP 特异性磷酸二酯酶有选择性抑制作用。
利用 ADMETlab 平台评估抑制剂的药代动力学和毒理学性质，发现所有天然产物吸收特性欠佳，黄酮苷在分布、排泄和毒性方面表现较好，但代谢性质差；香豆素衍生物 macrosporusone A 在代谢和排泄方面有优势，但分布和毒性方面存在不足，表明需要对这些化合物进行结构修饰和优化以提升其成药特性。
研究总结与展望
结核病治疗面临诸多挑战，现有治疗方案疗程长、费用高、患者依从性差，且耐药菌株不断出现。卡介苗对青少年和成人保护有限。宿主导向疗法（HDT）虽有前景，但也面临诸多难题。
CdnP 作为抗结核靶点具有重要意义，其抑制剂可增强宿主免疫反应，规避传统抗生素耐药机制，降低耐药风险，与直接作用的抗结核药物联合使用有望缩短治疗时间、提高患者依从性。此前虽有研究探索 CdnP 抑制剂，但缺乏体内有效性证据。
本研究发现的四种天然 CdnP 抑制剂在酶学和 SPR 实验中表现出显著的抑制活性和结合亲和力。MD 模拟揭示其双抑制机制：竞争性占据产物（AMP）结合位点，同时限制底物（pApA）结合域的构象可塑性。进化分析表明这些抑制剂对细菌 CdnP 同源物具有广谱活性，对宿主磷酸二酯酶抑制作用小，具有良好的选择性。与 FDA 批准的 PDE 抑制剂相比，这些天然产物更具开发为新型抗结核疗法的潜力。
未来研究应聚焦于这些化合物的结构优化，并在临床前结核模型中评估其疗效，推动其作为耐药结核病宿主导向疗法的发展，为全球结核病防控提供新的策略和药物选择。
