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本文聚焦于乳酸杆菌（LAB），研究从日本泡菜中分离出的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）的免疫调节能力。通过基因组分析，鉴定出相关基因，揭示其免疫调节机制，为 LAB 在健康领域的应用提供了关键依据。
引言
乳酸杆菌（LAB）作为革兰氏阳性、耐酸细菌，在食品工业中备受关注。其发酵碳水化合物能产生乳酸及有益代谢物，影响食品风味、保质期和健康功效。许多 LAB 被认为是安全的，部分菌株作为益生菌，可调节胃肠道、免疫、肠道微生物群并预防病原体。LAB 还可作为疫苗和治疗载体，不过其免疫调节能力仍需在基因组层面深入探索。
LAB 通过与肠道免疫细胞相互作用调节宿主免疫系统，诱导抗炎和促炎细胞因子表达，如白细胞介素 - 10（IL-10）和白细胞介素 - 12（IL-12）。这一过程涉及微生物相关分子模式（MAMPs）和模式识别受体（PRRs），不同的 MAMPs 可引发不同的免疫反应，但 LAB 诱导细胞因子的关键基因尚未明确。
随着高通量测序技术发展，基因组研究为 LAB 的遗传变异、生态适应和工业发酵提供了见解。植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）在发酵食品中常见，具有免疫调节作用，但二者免疫调节能力的遗传差异尚不清楚，需要新的比较基因组分析方法来识别相关基因。
日本泡菜富含植物源营养，是分离这两种乳杆菌的良好资源。本研究旨在确定日本泡菜源菌株的免疫调节能力，通过测量 61 株 LAB 菌株刺激产生的 IL-10 和 IL-12 水平，对菌株进行分组，并利用潜在基因（PG）指数确定免疫调节相关基因，最后在小鼠模型中验证了一株菌株的 IL-10 诱导能力。
结果
日本泡菜中亲缘相近的 LAB 在进化枝中表现出细胞因子诱导的相似性
研究人员评估了 61 株分离菌株和 2 株模式菌株诱导 IL-10 和 IL-12 的能力，并分析其基因组，以确定它们在基因组水平的免疫调节相似性。重新确认了菌株分类，发现两物种内平均核苷酸同一性和四核苷酸频率较高，且戊糖乳杆菌分离株基因组更大、GC 含量更高。
细胞因子诱导研究表明，两物种中 IL-12 平均产量显著高于 IL-10。酶联免疫吸附测定（ELISA）和单核苷酸多态性（SNP）系统发育树显示了两物种的免疫调节进化枝。植物乳杆菌中存在不同的细胞因子诱导进化枝，最强的 IL-12 诱导进化枝由 NG3-L2 至 NG3-L5 菌株组成，IL-10 刺激进化枝分布在两个分支上；戊糖乳杆菌中也存在相反细胞因子诱导能力的进化枝，IL-10 诱导进化枝由 KY6-L10 至 KY5-L6 菌株组成，IL-12 调节进化枝包括 JCM1558 至 KY4-L7 菌株 。
细胞因子诱导进化枝中存在共享的免疫调节相关基因
免疫刺激进化枝的发现表明，亲缘相近的活性菌株可能拥有共同的免疫刺激相关基因。研究人员利用 PG 指数，通过比较基因组分析来识别这些基因。他们假设免疫调节（活性和沉默）组中相应基因在两组间存在平行遗传差异，通过重新计算 Calinski-Harabasz（CH）指数进行筛选。
在筛选出的合格直系同源基因群（OGs）中，植物乳杆菌中TagF（group_1590）在 IL-10 和 IL-12 比较中均排名前三；戊糖乳杆菌中，TagF（group_728）和secA在 IL-10 和 IL-12 比较中具有高重新计算的 CH 指数，表明活性和沉默组间存在明显遗传距离。
具有相反细胞因子诱导能力的假定 MAMP 生物合成基因被鉴定
研究人员鉴定出编码TagF（一种 GroP 聚合酶）的候选免疫刺激基因，该基因参与聚甘油 - 3 - 磷酸型壁磷壁酸（poly-GroP WTA）的生物合成，poly-GroP WTA 是一种潜在的细胞因子诱导 MAMP。多维缩放分析（MDS）和系统发育分析证实了候选基因中活性和沉默组间的遗传距离。
在植物乳杆菌中，TagF2（group_1590）的不同簇与 IL-10 或 IL-12 诱导相关，IL-10 刺激进化枝的簇 2 与 IL-12 诱导进化枝的簇 1 距离较远；戊糖乳杆菌中，TagF2（group_728）的 IL-10 调节进化枝的簇 1 与几乎不刺激 IL-10 或 IL-12 产生的菌株簇 2 距离较远 。
植物乳杆菌 WCFS1 中的TagD1-TagF1-TagF2（tag-locus）基因簇在 poly-GroP WTA 产生中起关键作用，不同TagF基因编码的蛋白质长度不同，推测较短的变体可能作为 GroP 引物（TagB），较长的为TagF2。
在植物乳杆菌中，KY4-L3、KY4-L6 等菌株基因组中保守有TagD（group_2093）-TagF1和TagF2（group_1590）的基因排列，不同簇中TagF2蛋白氨基酸序列长度不同，且邻近基因功能各异。戊糖乳杆菌中也有类似的tag-locus，部分菌株基因排列存在差异，TagF2蛋白长度不同，与 IL-12 诱导情况相关 。
由于 IL-10 诱导菌株 KY4-L3 具有合成 poly-GroP WTA 的潜力，研究人员在小鼠模型中对其进行体内验证。结果显示，口服灌胃 KY4-L3 后，小鼠脾脏中 CD138+/CD19+浆母细胞数量显著增加，派尔集合淋巴结中 GL7+/CD19+生发中心 B 细胞数量有减少趋势，表明 KY4-L3 具有潜在的 IL-10 诱导能力，其合成的 poly-GroP WTA 可能是激活抗炎细胞因子产生的有效 MAMP 。
此外，研究人员还鉴定出亚潜在免疫刺激基因，与 WxL 结构域（group_511）和 LPXTG 基序细胞壁锚定蛋白（group_3159）相关，这些基因与细胞间通讯或黏附到人体肠道上皮细胞有关，部分与TagF2（group_1590）保守菌株重叠，暗示其作为共生菌的潜在益生菌作用。
讨论
研究发现植物乳杆菌和戊糖乳杆菌存在免疫调节进化枝，具有菌株依赖性的 IL-10 或 IL-12 诱导能力，部分菌株能刺激其他抗炎和促炎细胞因子，且两种乳杆菌的细胞因子诱导菌株表现出免疫调节个性，不同地区菌株的 IL-10 和 IL-12 平均产量存在差异。
通过泛基因组分析鉴定出益生菌标记基因，但传统分析未检测到直接参与有效 MAMPs 的基因。PG 指数确定TagF2是参与 poly-GroP WTA 生物合成的关键免疫调节相关基因，暗示了这种细胞壁成分在细胞因子诱导中的有效 MAMPs 作用，后续对TagD-TagF1-TagF2基因座的探索进一步证实了这一可能性 。
体内验证证实了一株植物乳杆菌TagF2（group_1590）的 IL-10 诱导能力，表明该基因簇产生的 poly-GroP WTA 具有诱导抗炎细胞因子的能力。两物种中 IL-10 和 IL-12 刺激簇的氨基酸和大小差异表明合成的 poly-GroP WTA 不同，对细胞因子诱导有不同影响 。
本研究揭示了分离菌株的免疫刺激关系，确定了TagF2和 poly-GroP WTA 的潜在免疫调节作用，尽管未提取 poly-GroP WTA，但小鼠模型表明其具有刺激抗炎细胞因子的作用。基于 PG 指数的基因筛选分析有效识别了两物种的免疫调节相关基因，为未来发现潜在益生菌 LAB 的健康益处相关基因提供了参考。
材料和方法
样本采集和测序
从日本微生物保藏中心（JCM）获取 2 株模式菌株，从日本泡菜中收集 61 株原始菌株，这些泡菜由来自四个县的八个制造商提供。使用含有环丙沙星的植物乳杆菌选择性培养基（LPSM）分离 LAB，通过 16S rRNA 基因 PCR 扩增鉴定菌株，纯化后保存。提取细菌 DNA，进行文库制备和测序，在 HiSeq X 平台上生成 150 bp 双端读数 。
基因组整理
对测序数据进行质量控制，使用 fastp 修剪原始读数，SPAdes 进行基因组组装，CheckM 计算基因组完整性和污染，对污染超 5% 的基因组用 UniCycler 重新组装。计算基因组大小和 GC 含量，用 Prokka 注释基因组，Roary 构建 OGs 和泛基因组，提取 SNP 基因并构建系统发育树，使用相关工具进行可视化分析 。
分离菌株和模式菌株的免疫调节分析
将菌株在 MRS 琼脂培养基上厌氧培养，制备预培养物和主培养物，离心洗涤后调整浓度。培养人 THP-1 单核细胞并诱导分化为 M2 巨噬细胞，将 LAB 菌株与 M2 巨噬细胞共培养，收集上清液，用 ELISA 试剂盒测量 IL-10 和 IL-12 水平，根据细胞因子产量将菌株分为 “活性” 和 “沉默” 两类 。
活性和沉默组之间的比较基因组分析
使用 Roary 构建 61 株 LAB 菌株的 OGs，排除单菌株或缺失的 OGs，保留多菌株保守的 OGs 进行比较基因组分析。引入序列分布因子（seq_dist_factor）调整 CH 指数得到 PG 指数，计算相关矩阵和指数，筛选出前 2% 的 OGs，进行 k-means 聚类分析和 CH 指数重新计算，保留在 IL-10 和 IL-12 比较中重叠的前三个 OGs 进行基因功能探索，通过统计检验确定 PG 指数差异的显著性 。
基因内容探索
使用内部脚本提取候选基因的氨基酸序列，在 NCBI 非冗余蛋白序列数据库中查询并可视化结果，保留潜在免疫调节基因进行 MDS 和系统发育树分析，获取 poly-GroP WTA 生物合成相关基因的位置信息并可视化 。
潜在菌株的小鼠模型验证
根据 ELISA 测量和比较基因组分析结果选择潜在菌株，制备 PBS 悬浮液并进行热处理。用 C57BL/6 小鼠建立模型，喂养含或不含热灭活 LAB 的水 4 周，制备脾脏和派尔集合淋巴结细胞 。
流式细胞术
使用特定抗体对细胞进行染色，在 MACSQuant 流式细胞仪上分析，用 FlowJo 进行数据分析 。
统计分析
实验数据以平均值 ± 标准差表示，使用单向方差分析和 Bonferroni 校正评估未配对数据的统计学显著性 。
