揭秘 m6A 甲基化调控肢体发育中软骨生成的关键机制

在肢体发育过程中，m6A RNA 甲基化对软骨生成的作用尚不明确。为探究此问题，研究人员利用肢体祖细胞特异性敲除 Mettl14 的小鼠开展研究，发现 m6A 通过 GDF5–RUNX–细胞外基质（ECM）基因轴调控软骨生成，这揭示了肢体骨骼发育中软骨生成的关键调控机制。

　　在生命的奇妙旅程中，胚胎发育一直是科学界热衷探索的神秘领域。肢体的形成作为胚胎发育的重要环节，蕴含着无数有待解开的谜题。在众多影响肢体发育的因素中，RNA 的修饰作用逐渐成为研究热点。N⁶- 甲基腺苷（m⁶A）是真核生物 mRNA 中最丰富的内部修饰之一，它在哺乳动物发育的诸多方面都至关重要，然而其在软骨生成过程中的具体作用却如同被迷雾笼罩，知之甚少。在骨骼发育的过程中，软骨生成是构建肢体骨骼的基础，一旦软骨生成出现异常，就可能导致肢体畸形等严重问题。因此，深入探究 m⁶A 在软骨生成中的作用机制，对于理解肢体发育的正常进程、揭示相关疾病的发病机制以及寻找潜在的治疗靶点都具有极其重要的意义。
为了揭开这层神秘的面纱，美国明尼苏达大学干细胞研究所（Stem Cell Institute, University of Minnesota）和遗传学、细胞生物学与发育系（Department of Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota）的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们通过构建肢体祖细胞特异性敲除 Mettl14（m⁶A 甲基转移酶复合物的关键亚基）的小鼠模型，深入剖析 m⁶A 在肢体发育中软骨生成的调控机制。研究结果表明，m⁶A 对软骨生成和肢体形态发生至关重要，它通过稳定生长分化因子 5（GDF5）、转录因子 RUNX2 和 RUNX3 的转录本，激活下游的细胞外基质（ECM）基因，从而形成了一条对肢体骨骼发育中软骨生成至关重要的 m⁶A 依赖的调控级联。这一发现为理解肢体发育的分子机制提供了新的视角，也为相关疾病的研究和治疗开辟了新的方向。该研究成果发表在《Nature Communications》杂志上，为该领域的发展注入了新的活力。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过构建肢体祖细胞特异性敲除 Mettl14 的小鼠模型，为研究 m⁶A 在软骨生成中的作用提供了重要的实验对象。其次，利用定量质谱技术、RNA 测序（RNA-seq）、m⁶A 测序（m⁶A-seq）和单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）等多组学技术，全面分析了基因表达和 m⁶A 修饰水平的变化。此外，运用核运行分析、mRNA 稳定性分析、基因敲低实验和过表达实验等方法，深入探究了相关基因之间的调控关系。
研究结果具体如下：

• Mettl14 条件性敲除（cKO）破坏肢体骨骼形态发生：研究人员利用 Prx1-Cre 驱动因子条件性敲除 Mettl14，qRT-PCR 证实敲除效率高。cKO 小鼠出生时肢体短小，骨骼和软骨染色显示肢体短骨且指骨未骨化。原位杂交表明胚胎期肢体发育异常。同时，细胞增殖和凋亡相关检测显示，短肢并非由细胞增殖减少或死亡增加导致。
• Mettl14 cKO 下调肢体芽中的软骨和 ECM 蛋白：通过定量质谱分析，研究人员发现 cKO 小鼠肢体芽中与 mRNA 甲基化相关蛋白上调，而与 ECM 和软骨发育相关的 21 种蛋白下调，其中 11 种蛋白的突变会影响肢体发育或软骨生成。
• Mettl14 cKO 下调肢体芽中的软骨和 ECM mRNA：RNA-seq 结果显示，cKO 小鼠中不到 13% 的 mRNA 表达发生变化，且 mRNA 和蛋白水平变化存在差异。GO 分析表明，cKO 小鼠中与软骨、骨和 ECM 相关的基因下调，同时发现一些信号通路基因和组蛋白甲基转移酶基因上调。此外，Mettl14 cKO 对可变剪接影响较小。
• Mettl14 cKO 降低肢体芽中软骨和 ECM mRNA 的 m⁶A 水平：m⁶A-seq 分析发现，cKO 小鼠中约 47.5% 的 m⁶A 峰下调。多数 m⁶A 修饰的 mRNA 水平下降，且 m⁶A 与 mRNA 的共调控模式主要为低甲基化和转录本上调。比较蛋白和 m⁶A 水平发现，多数 m⁶A 水平变化不影响蛋白水平。
• Mettl14 cKO 在单细胞水平下调软骨细胞和 ECM mRNA：scRNA-seq 分析将 E12.5 肢体芽细胞分为 8 个细胞类型簇，发现 Mettl14 cKO 主要影响软骨细胞和间充质细胞簇中与 ECM 和软骨细胞分化相关的基因表达，且软骨细胞和软骨膜细胞是 Col1、Col9 和 Col11 等基因的主要表达来源，在 cKO 肢体芽中这些基因通常下调。
• Gdf5、Runx 和 ECM 基因的遗传通路：核运行分析表明，多数 ECM 和软骨基因的 mRNA 减少是由于转录下调，而 Gdf5 可能存在其他机制。敲低实验证实 GDF5–RUNX2 和 RUNX3–ECM 基因的遗传通路，过表达 GDF5 实验进一步验证了该通路。scRNA-seq 数据显示相关基因在软骨细胞簇中的表达存在部分重叠，但基因表达异质性的来源尚不清楚。
• m⁶A 对 11 种软骨和 ECM mRNA 的调控：mRNA 稳定性分析表明，Mettl14 cKO 使 Gdf5、Runx2 和 Runx3 的 mRNA 不稳定。RRACH 基序突变实验表明，m⁶A 在维持这些 mRNA 稳定性中起直接作用。同时，研究发现翻译抑制并非 11 种蛋白减少的原因。
  研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 METTL14 依赖的 m⁶A 在 mRNA 水平对软骨生成的调控作用，提出了 m⁶A 通过稳定 Gdf5 mRNA，激活 Runx2 和 Runx3，进而调控 ECM 基因表达的调控模型。这一发现不仅加深了人们对软骨发育复杂性的理解，还为研究肢体发育相关疾病的发病机制提供了重要线索。此外，研究还表明多数 m⁶A 峰减少不影响 mRNA 或蛋白水平，建议在转录组学研究中，蛋白质定量应作为鉴定候选基因的首要步骤。该研究为后续相关研究奠定了坚实的基础，有望推动肢体发育和相关疾病治疗领域的进一步发展。