综述：用于肿瘤类器官培养的可重现细胞外基质：挑战与机遇

这篇综述聚焦肿瘤类器官培养中细胞外基质（ECM）的重要作用。探讨了传统基质（如 Matrigel、胶原蛋白）的局限，介绍合成 / 工程化基质和生物聚合物基基质的进展。为肿瘤研究和临床应用中优化类器官模型提供参考，助力精准医学发展。

　　

肿瘤类器官培养模型的兴起与挑战

在癌症研究领域，传统的研究模型存在诸多不足。体外二维（2D）细胞培养容易积累基因突变，并且缺乏基质成分，无法反映肿瘤的真实异质性；基因工程动物模型虽然能模拟肿瘤结构和血管，但不仅耗费大量人力，还不能准确复制人类疾病过程；常规细胞培养和动物模型都难以重现天然肿瘤免疫微环境；患者来源的肿瘤异种移植和人源化免疫肿瘤模型虽然有所改进，但成本高昂、制备时间长，还存在免疫相容性问题。

肿瘤类器官模型作为一种三维（3D）体外培养系统，能够保留组织的天然细胞成分和结构组织，以及肿瘤（免疫）微环境、遗传和组织学异质性，在肿瘤研究中具有重要意义。然而，目前癌症类器官培养技术在控制和可重复性方面仍存在问题，培养过程中的多个环节，如细胞外基质（ECM）、培养基、癌症组织来源和处理等都缺乏标准化。

类器官培养策略

类器官培养模型是研究肿瘤生物学和肿瘤免疫微环境（TIME）的有力工具。其细胞来源多样，包括多能干细胞（PSCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）和成人干细胞（AdSCs），但干细胞来源的类器官往往缺乏完整的免疫、基质和血管成分，限制了其对天然肿瘤微环境的模拟。

另一种方法是将肿瘤组织通过酶解和 / 或机械消化成小碎片或单个细胞，然后嵌入三维基质（如胶原蛋白或 Matrigel）中进行培养。培养过程中，还需在培养基中添加特定组合的生长因子和信号分子（如 R-spondin、表皮生长因子（EGF）、Wnt3A 和 Noggin 等），以满足不同肿瘤类型的生长需求。此外，添加 Rho 激酶抑制剂 Y-27632 可促进细胞在培养早期的存活，提高类器官的生长和传代效率。

为更好地模拟肿瘤微环境，研究者开发了多种类器官培养策略。其中，重构方法（如浸没式 Matrigel 培养）是将主要由上皮细胞组成的类器官嵌入含有多种生长因子的凝胶中，后期再引入外源免疫细胞或癌相关成纤维细胞来重建肿瘤微环境，用于免疫治疗研究；整体方法则是通过维持肿瘤组织的小而完整的片段来保留天然的肿瘤微环境，如微流控 3D 培养和空气 - 液体界面（ALI）培养。微流控 3D 培养是将肿瘤组织消化后，筛选出特定大小的肿瘤球，与胶原蛋白混合后引入微流控装置；ALI 培养是将肿瘤组织与胶原蛋白溶液混合后置于特殊装置中，通过透气膜进行营养物质的扩散和氧气的供应，以维持肿瘤细胞与其天然免疫和基质细胞的相互作用。

ECM 在肿瘤类器官培养中的重要性

天然组织的 ECM 是一个复杂且动态的聚合物网络，由蛋白质、多糖和蛋白聚糖等组成。它不仅通过胶原蛋白和弹性蛋白等提供结构支持，维持组织的完整性和三维结构，还能通过糖蛋白（如层粘连蛋白和纤连蛋白）和蛋白聚糖来调节细胞行为。这些成分与细胞表面受体（如整合素）相互作用，启动信号级联反应（如粘着斑激酶途径），影响细胞的粘附、迁移、增殖和分化。同时，ECM 的机械特性（如刚度、粘弹性）可通过机械转导机制被细胞感知，进一步指导细胞反应。

肿瘤组织的 ECM 与健康组织不同，其在组成、结构和机械特性上会发生显著且无序的变化。这种变化的 ECM 可通过多种生化和生物力学相互作用，广泛改变肿瘤微环境的行为和特性，对肿瘤细胞的行为、肿瘤进展、转移以及对治疗干预的反应都至关重要。因此，理解 ECM 和细胞 - ECM 相互作用的多方面作用，对于设计具有可控和可调特性的新型合成基质，以重现天然生化信号和机械特性，提高肿瘤类器官模型的可重复性和临床相关性具有重要意义。

不同类型的 ECM 基质

天然生物聚合物基基质

• 小鼠 EHS 基质：过去十年，EHS 基质（一种基底膜提取物）在健康和肿瘤类器官的生成中被广泛应用，如 Corning Matrigel、Trevigen Cultrex 和 Gibco Geltrex 等。它含有多种 ECM 蛋白（主要是层粘连蛋白和胶原蛋白 IV），能为细胞提供物理和生物支持，其凝胶化过程简单，有利于类器官的生长和维持。然而，它存在诸多局限性，如动物来源导致的批次间差异大、含有不明确和异源污染物、成分复杂（含有近 2000 种不同蛋白质和 14000 多种独特肽）、生化和机械特性不可调、缺乏人类肿瘤组织中高比例的 I 型胶原蛋白和透明质酸（HA）、粘性大限制大规模应用、成本较高以及存在伦理问题等，这些限制了其在细胞 - ECM 相互作用研究、药物筛选和临床应用中的广泛使用。

• 胶原蛋白基质：在许多实体瘤中，胶原蛋白（主要是 I - IV 型）的沉积和重塑增加，其通过复杂的生化和生物力学信号影响肿瘤的多个方面。I 型胶原蛋白基质作为一种更常见的肿瘤微环境仿生材料，可作为 Matrigel 的经济替代品，用于体外肿瘤类器官模型的构建。它能在三维培养模型中重现肿瘤细胞的转移行为，且在空气 - 液体界面（ALI）类器官培养模型中，可促进长期的类器官培养，增强氧气运输，使类器官更好地成熟。此外，通过调整胶原蛋白 I 的浓度，还能调节其机械刚度，研究 ECM 刚度对细胞行为的影响。但胶原蛋白基质也存在与 Matrigel 类似的问题，如批次间差异、生物物理和生化可调性有限、可能存在污染、微观结构异质性、依赖与支持细胞共培养、控制机械性能可能需要使用潜在有毒试剂、可能破坏天然交联和配体可用性、调节刚度的选择有限等，因此需要严格标准化和精确控制凝胶化条件，或使用替代材料（如合成水凝胶、生物聚合物基工程基质）来克服这些限制。

• 脱细胞组织衍生基质：近年来，脱细胞技术的发展使得从各种肿瘤、器官、组织和细胞片中制备脱细胞细胞外基质（dECM）成为可能。dECM 保留了许多天然支架的生化信号，减少了对支架进一步化学修饰的需求，同时还保留了蛋白质谱、天然 ECM 结构和极性。多项研究表明，dECM 在癌症三维培养模型的开发中具有潜力，如利用人组织来源的 ECM 建立胶质母细胞瘤模型，以及使用肝脏 dECM 模拟肝细胞癌等。然而，dECM 也面临一些挑战，如供体数量和健康状况限制了其数量和质量，不同组织来源的 dECM 可能对类器官产生不利影响，调整其生物物理特性仍具有挑战性，dECM 水凝胶的化学性质会因来源和处理方法而异，导致结果的可靠性和可重复性较低。因此，在构建体外癌症模型前，需要对 dECM 进行全面表征，或者使用合成细胞外基质。

• 其他天然来源的 ECM：藻酸盐、明胶、透明质酸和纤维蛋白原等其他天然来源的 ECM 也可用于肿瘤类器官培养。它们具有生物相容性、价格低廉、易于修饰和功能化、化学定义明确（与 EHS 基质相比）、机械性能可调等优点，部分材料（如基于胶原蛋白和藻酸盐的材料）已获得 FDA 批准，具有广阔的应用前景。例如，研究发现，在特定条件下，无化学信号的藻酸盐支架也能支持多能干细胞分化为肠道类器官；透明质酸在神经类器官的生长和生成中应用广泛。但这些材料也存在批次间差异、细胞分化的化学信号有限、对某些类器官培养的适用性有限、可能无法完全复制天然 ECM 等问题。

合成 / 工程聚合物基基质

• 合成聚合物基基质：与体内肿瘤微环境中的天然生物分子不同，临床前癌症模型使用由生物相容性合成聚合物（如聚乙二醇（PEG）、聚己内酯（PCL）和聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）等）构建的简单支架。多项研究表明，合成基质在类器官培养中具有潜力，如 Gjorevski 等人开发的 PEG 基机械动态支架，可调节肠道干细胞类器官的生成；Hernandez - Gordillo 等人设计的完全合成的 PEG 基 ECM，能支持肠类器官和类器官的生长；Cruz - Acu?a 等人设计的 PEG 基支架，可高度重复地生成和扩增人类肠道类器官。PEG 基水凝胶具有价格低廉、商业可得、易于化学功能化、特性明确且可重复等优点，部分材料已获得 FDA 批准用于临床应用。然而，合成水凝胶也存在一些局限性，如需要进行生物物理和生化调整才能发挥功能，否则细胞可能难以附着，导致细胞凋亡；定制含有特定肽的水凝胶成本高且需要专业知识；合成水凝胶依赖细胞毒性引发剂，其降解产物可能具有细胞毒性，还可能含有未反应的基团，引发免疫反应，且合成聚合物通常会发生高膨胀，缺乏天然支架的细胞级结构特征。

• 生物聚合物基工程基质：为克服天然生物聚合物基和合成聚合物基基质的局限性，研究人员开发了生物聚合物基工程支架。例如，基于藻酸盐多糖和纯化丝蛋白的支架已用于肠道类器官的培养；Broguiere 等人开发的定制纤维蛋白 / 层粘连蛋白基质，可促进上皮类器官的长期培养；利用重组工程蛋白开发的水凝胶，可独立调节化学功能、刚度和粘弹性等特性，如 DiMarco 等人设计的重组工程支架，可用于原代类器官培养；Hunt 等人开发的 hyaluronan, elastin - like protein（HELP）支架，可促进肠类器官的形成、分化和传代。但蛋白质基水凝胶也存在一些问题，如并非所有蛋白质都能成功重组表达，蛋白质的折叠和功能实现存在挑战，特定的工程蛋白和自组装肽可能引发免疫反应，因此蛋白质生产通常在哺乳动物或酵母表达系统中进行。

• 混合基质：混合聚合物由天然生物聚合物与合成 / 工程聚合物组合而成，具有多种物理化学和生物学特性。例如，通过合成方法可调节胶原蛋白基支架的刚度，包括与合成聚合物交联、施加物理刺激或建立互穿聚合物网络（IPN）等；Bejoy 等人的研究表明，含有透明质酸和肝素的混合材料的刚度可影响神经干细胞的命运；Xiao 等人开发的用于原发性胶质母细胞瘤细胞三维培养的混合支架，可研究基质对肿瘤类器官表型和药物反应的影响。然而，混合基质存在设计和制造复杂、聚合物类型之间可能存在兼容性问题、生产成本高、优化材料性能困难等挑战。

结论与展望

与天然生物聚合物（如 Matrigel 和胶原蛋白）相比，工程化 / 合成基质的特定属性有望提高类器官模型的可重复性和效率。然而，目前工程化 / 合成支架的类器官培养效率往往低于 Matrigel，且适用于特定组织的合成水凝胶通常对其他组织缺乏直接适用性。这些限制可能源于其有限的生物降解性和重塑能力，以及与更复杂的动物来源基质相比，支架元素和细胞粘附因子的掺入较少。未来，聚合物科学和生物材料工程的发展需要解决这些关键限制，同时确保大多数研究人员能够方便地使用。此外，目前工程化基质在生物物理和生化特性的时空调节方面存在限制，一些研究已致力于开发能够在空间和时间上可逆和不可逆地修饰支架生化和生物力学特性的平台。未来，预计类器官培养将逐渐从使用 EHS 基质转向开发新的、定义明确的材料，以便更精确地控制细胞的机械和化学微环境，推动肿瘤研究和临床应用的发展。